BAB 4

METODE PENELITIAN

4.1 Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian true experimental dengan

menggunakan metode post test only control group design.

4.2 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Biomedik Fakultas

Kedokteran Universitas Muhammadiyah Malang pada bulan Februari 2018
selama kurang lebih 36 hari.

4.3 Populasi dan Sampel

4.3.1 Populasi
Populasi penelitian adalah tikus putih (Rattus novergicus) strain wistar

dewasa dengan jenis kelamin jantan, berat badan 150-250 gram, dengan umur 2-

3 bulan, Sehat, ditandai dengan gerakan yang aktif (normal) dan bulu yang tebal

berwarna putih serta matanya jernih (Smith dan Mangkuwidjojo, 1998).

4.3.2 Sampel
Sampel diambil dari populasi tikus putih (Rattus novergicus) strain wistar
jantan sebagai hewan coba. Sampel terdiri atas 4 kelompok.

4.3.3 Besar Sampel

Estimasi besar replikasi yang digunakan pada penelitian ini adalah dengan
rumus berikut:

(r – 1)(p – 1) ≥ 15

(r – 1)(4 – 1) ≥ 15

4r – 3 ≥ 15

r ≥ 4,5 (Supranto, 2007)

25
 26

E = total number of animal – total number of group

= (5x4) – 4 = 16

n’ = = =5

( Sudigo dan Sofyan, 2016)

Keterangan:

p = perlakuan

r = jumlah replikasi perlakuan

Dalam penelitian ini dibagi menjadi 4 kelompok dengan menggunakan 4

ekor tikus di setiap kelompok sehingga jumlah total tikus minimal yang

digunakan adalah 16 ekor. Masing – masing kelompok diberikan 1 ekor tikus

cadangan untuk mengantisipasi adanya tikus yang sakit atau mati saat proses

adaptasi atau penelitian sehingga di dalam penelitian ini total tikus yang

digunakan adalah 20 ekor tikus.

4.3.4 Teknik Pengambilan Sampel

Pengambilan sampel dilakukan dengan menggunakan teknik pengambilan

sampel simple random sampling.

4.3.5 Karakteristik Sampel Penelitian

a. kriteria Inklusi Tikus Putih:

1) umur 2-3 bulan

2) Berat badan 150-250 gram

3) Jantan, strain wistar

 27

4) Sehat, ditandai dengan gerakan yang aktif (normal) dan bulu yang

tebal berwarna putih serta matanya jernih (Smith dan

Mangkuwidjojo, 1998).

b. Kriteria Drop Out

1) Tikus yang sakit selama penelitian

Jika kondisi diatas tidak terpenuhi, maka tikus menjadi sakit.

Beberapa indikator yang dapat digunakan untuk menilai apakah tikus

sehat atau sakit adalah (Hubrecht dan Kirkwood, 2010):

- Penampilan umum, pada tikus yang sakit dapat terlihat piloereksi,

bulu rontok, kulit kendur, berat badan menurun, kelopak mata

tertutup.

- Feses, feses yang lembek dan diare menunjukkan terjadinya

gangguan pada saluran pencernaan.

- Tingkah laku, tikus yang sakit akan menjadi lebih agresif

awalnya, namun lambat laun akan menjadi pasif.

- Postur, umumnya tikus yang sakit akan sering tiduran di lantai

kandang, dengan posisi kepala menyentuh abdomen.

- Pergerakan, pergerakan pada tikus yang sakit sangat berkurang.

- Suara, tikus yang sakit akan lebih banyak mencicit ketika

dipegang.

- Fisiologi, dapat terjadi bersin, hipotermia, serta penampilan yang

pucat.

2. Tikus yang mati selama adaptasi dan atau perlakuan

 28

4.4 Variabel Penelitian

4.4.1 Variabel Bebas

Ekstrak Kulit Jeruk Lemon

4.4.2 Variabel Tergantung

Kadar HDL pada tikus putih jantan (Rattus novergicus strain wistar).

4.5 Definisi Operasional

No. Variabel Definisi Alat Ukur Hasil Ukur Skala

Operasional Ukur
1. Ekstrak Ekstrak kulit jeruk Timbangan mg/kgBB Kategorik
kulit jeruk lemon adalah
lemon ekstrak kulit jeruk
(Citrus lemon kering yang
limon) dimaserasi
menggunakan
sistem pelarut
etanol 96% dan
aseton dengan
dosis 125
mg/kgBB, 250
mg/kgBB dan 500
mg/kgBB
2. Kadar Kadar HDL tikus Menggunakan mg/dL Numerik
HDL putih normal 35 autoanalyzer
mg/dl (Rattus
novergicus strain
wistar)
 29

4.6 Bahan dan Instrumen Penelitian

4.6.1 Bahan

a. Ekstrak Kulit Jeruk Lemon (Citrus limon)

b. Induksi minyak goreng deep frying 1ml/100 gram BB atau sama

dengan 1,5 – 2,5 ml peroral (Sutejo dan Dewi, 2012)

c. Reagen untuk pemeriksaan kadar HDL (High Density Lipid)

d. Diet pakan tikus BR-1

e. Kloroform

(Perret-gentil, M. I., 2007)

4.6.2 Instrumen

a. Alat Pemeliharaan Tikus

1) Kandang tikus

2) Penutup kandang dari anyaman kawat

3) Botol air

4) Timbangan

5) Tempat makan tikus

b. Alat Pembedahan Tikus

1) Gunting

2) Pinset

3) Botol sediaan

4) Handscoon

5) Pengait jaringan

6) Pisau bedah

c. Alat lain
 30

1) Sonde

2) Mikroskop

3) Mikrometer square

4) Kamera digital

5) Botol film

6) Spuit injeksi 3 ml

7) Label

(Perret-gentil, M. I., 2007)

4.7 Prosedur penelitian

4.7.1 Pembagian Kelompok Tikus

Dalam penelitian ini dibagi menjadi 4 kelompok dengan menggunakan 4

ekor tikus di setiap kelompok sehingga jumlah total tikus minimal yang

digunakan adalah 16 ekor. Masing – masing kelompok diberikan 1 ekor tikus

cadangan untuk mengantisipasi adanya tikus yang sakit atau mati saat proses

adaptasi atau penelitian sehingga di dalam penelitian ini total tikus yang

digunakan adalah 20 ekor tikus.

a. Kelompok 1: diberikan induksi minyak goreng deep frying selama 14

hari tanpa pemberian ekstrak kulit jeruk lemon, kemudian diberi

pakan standar pada 15 hari berikutnya.

b. Kelompok 2: diberikan induksi minyak goreng deep frying 1

ml/100gr BB tikus selama 14 hari dengan pemberian ekstrak kulit

jeruk lemon sebanyak 25 mg/ekor/hari selama 15 hari.

 31

c. Kelompok 3: diberikan induksi minyak goreng deep frying 1

ml/100gr BB tikus selama 14 hari dengan pemberian ekstrak kulit

jeruk lemon sebanyak 50 mg/ekor/hari selama 15 hari

d. Kelompok 4: diberikan induksi minyak goreng deep frying

1ml/100gr BB tikus selama 14 hari dengan pemberian ekstrak kulit

jeruk lemon sebanyak 100 mg/ekor/hari selama 15 hari

4.7.2 Adaptasi

Proses adaptasi hewan coba dilakukan selama 7 hari di dalam kandang

agar mencit dapat menyesuaikan diri terhadap lingkungan yang baru. Selama

adaptasi mencit diberikan pakan standar BR-1 yang mengandung air 13%, protein

23%, lemak kasar 5%, abu 7%, Ca 0,3%, P 0,6%, serat 5%, secara sonde lambung

sebanyak 15g/hari serta minum ad libitum (Zuraida, et al, 2011).

4.7.3 Penentuan Dosis Ekstrak Kulit Jeruk Lemon

Dosis yang dipakai untuk ekstrak kulit jeruk lemon dengan menggunakan

3 dosis, yaitu 125 mg/kgBB, 250 mg/kgBB dan 500 mg/kgBB (Muhtadi et al,

2015). Berat tikus adalah sekitar 200 gr sehingga ekstrak kulit jeruk lemon yang

diberikan yaitu:

Dosis I = 125 mg/kgBB x 0,2 = 25 mg/ekor/hari

Dosis II = 250 mg/kgBB x 0,2 = 50 mg/ekor/hari

Dosis III = 500 mg/kgBB x 0,2 = 100 mg/ekor/hari

 32

4.7.4 Pembuatan Minyak Goreng Deep Frying

Pembuatan minyak goreng deep frying menggunakan minyak goreng

kemasan yang dipanaskan berulang sebanyak lima kali untuk menggoreng ubi.

Proses penggorengan dimulai dengan memasukkan minyak goreng ke dalam

ketel/panci sebanyak ± 2500mL, kemudian ketel dipanaskan hingga mencapai

suhu 180ºC, sebanyak 1kg ubi digoreng dalam minyak tersebut selama 10 menit.

Kemudian minyak didiamkan tunggu hingga dingin dan dilanjutkan pemanasan

berikutnya sampai pemanasan ke-5. Minyak yang digunakan adalah minyak yang

sama (tidak diganti dan tidak dilakukan penambahan volume minyak segar).

Minyak goreng deep frying didapatkan dari membeli minyak goreng di pasar

Mergan dan diberikan kepada penjual makanan cepat saji (Ratih, 2016).

4.7.5 Pemberian Minyak Goreng Deep frying

Pemberian minyak goreng deep frying pada tikus diberikan 1 kali dalam

sehari 1ml/100gr BB tikus atau setara dengan 1,5 – 2,5 ml peroral melalui sonde.

Dalam penelitian sebelumnya menunjukkan pemberian minyak goreng deep

frying dapat menurunkan kadar HDL pada tikus (Sutejo dan Dewi, 2012)

4.7.6 Pembuatan Ekstrak Kulit Jeruk Lemon (Citrus limon)

a. Pembuatan serbuk kulit lemon

Kulit jeruk lemon yang dikumpulkan, dibersihkan dan dipotong –

potong kecil, dikeringkan, dan diblender menjadi bubuk. Bubuk

kering ditimbang dan siap untuk diekstrak (Mohamed et al, 2009).

 33

b. Proses ekstraksi

Ekstrak kulit jeruk lemon disiapkan dengan maserasi atau

perendaman menggunakan sistem pelarut etanol 96% dan aseton

dengan rasio 4:1 yang dijauhkan dari sinar matahari dan diaduk

selama 3 hari. Maserasi lalu difilter dengan corong Buchner. Ampas

yang tersisa dimaserasi kembali dua kali lagi. Filtrasi dari ekstrak

digabungkan dan dipekatkan menggunakan evaporator untuk

mendapatkan ekstrak kering (Mohamed et al, 2009).

Ekstrak kulit jeruk lemon yang dibutuhkan dalam penelitian ini adalah

sebagai berikut:

Dosis 1 (untuk 7 tikus selama 15 hari) : 25 x 7 x 15 = 2.625 mg

Dosis 2 (untuk 7 tikus selama 15 hari) : 50 x 7 x 15 = 5.250 mg

Dosis 3 (untuk 7 tikus selama 15 hari) : 100 x 7 x 15 = 10.500 mg

Jadi, total kebutuhan ekstrak kulit jeruk lemon sebanyak 18.375 mg.

4.7.7 Proses Pengambilan Darah, Anastesi dan Pembedahan Hewan Coba

a. Proses Anastesi

Tahap ini dilakukan dengan memasukkan hewan coba ke dalam

toples kaca yang sebelumnya sudah diberi kapas yang mengandung

kloroform. Pembiusan dilakukan satu persatu dengan harapan

pembiusan dapat dilakukan secara inhalasi dengan dosis kloroform

0,67ml/hewan coba selama 60 detik yang dihitung menggunakan

 34

stopwatch. lalu membiarkan sampai tikus tidak bergerak, tunggu

selama 20 detik, jika hewan coba mengalami recovery maka harus

dilakukan prosedur euthanasia, salah satunya dengan prosedu

Cervical Dislocation, yaitu dengan cara memisahkan tengkorak dan

vertebrae (Alexandru, 2011; Perret-gentil, M. I., 2007).

b. Proses Pembedahan

Setelah hewan coba teranastesi dengan baik,. hewan coba diletakkan

pada meja lilin dan keempat kaki hewan coba difiksasi terhadap meja

lilin dengan menggunakan jarum pentul. Dengan menggunakan

gunting bedah, dilakukan pembedahan pada abdomen hingga

setinggi leher. Dengan menggunakan spuit 3 ml, darah hewan coba

diambil dari ventrikel kiri sebanyak ± 3 ml (Alexandru, 2011).

4.7.8 Penguburan Tikus Percobaan

Setelah hewan coba dibedah, harus dipastikan bahwa hewan coba tidak

mengalami recovery. Sebelum dilakukan penguburan hewan coba, dipastikan

bahwa denyut nadi sudah berhenti. Setelah dibedah, hewan coba akan dikuburkan

dengan cara (SEPA,2009) :

1. Tikus dibungkus dengan polibag

2. Tikus dimasukkan ke dalam lubang pada tanah yang kering dengan

kedalaman 1 meter dan jarak minimal 250 meter dari sumber air

3. Masing-masing lubang berisi tidak lebih dari sepuluh ekor tikus

 35

4.7.9 Pemeriksaan Kadar High Density Lipoprotein

Pemeriksaan kadar HDL menggunakan sampel serum darah dengan

metode CHOD-PAP (Ratna, 2008).

- Persiapan Sampel 500 µL dan reagen presipitasi HDL 1000 µL

- Presipitasi dengan cara makro

- Campur dan biarkan selama 10 menit pada suhu kamar dan sentrifugasikan

selama 10 menit pada 4000 rpm, atau selama 2 menit pada 12.000 rpm.

- Prosedur Pemeriksaan

Panjang gelombang : Hg 546 nm

Spektrofotometer : 500 nm

Kuvet : diameter dalam 1 cm

Suhu inkubasi : 20 - 25°C atau 37°C

- Bahan

a. Aqua bidestilata : blanko 100 µL

b. Supernatan : sampel 100 µL

c. Larutan reagen kolesterol : blanko 1000 µL sampel 1000 µL

Campur dan inkubasikan selama 10 menit pada suhu 20 - 25°C atau

selama 5 menit pada suhu 37°C kemudian baca absorbansi sampel ( A

sampel ) terhadap Blanko dalam waktu 60 menit.

 Kalkulasi
ΔA Sampel
HDL (mg/dl) = x Konsentrasi standar (mg/dl)
ΔA Standar
 36

4.8 Alur Penelitian

Adaptasi hewan coba selama 7 hari (Pengelompokkan hewan coba menjadi 4 kelompok)

Pemberian pakan dan minum standar (BR – 1)

Pemberian perlakuan mulai hari ke-8 sampai hari ke-36

Kelompok I Kelompok II Kelompok III Kelompok IV

Induksi minyak Induksi minyak Induksi minyak Induksi minyak

goreng deep frying goreng deep frying goreng deep frying goreng deep frying
1ml/100 gram 1ml/100 gram 1ml/100 gram 1ml/100 gram
selama 14 hari selama 14 hari selama 14 hari selama 14 hari

Kelompok I Kelompok II Kelompok III Kelompok IV

Tanpa pemberian Ekstrak kulit jeruk Ekstrak kulit jeruk Ekstrak kulit jeruk
ekstrak kulit jeruk lemon dengan lemon dengan lemon dengan
lemon dosis 25 dosis 50 dosis 100
mg/ekor/hari mg/ekor/hari mg/ekor/hari
selama 15 hari selama 15 hari selama 15 hari

Anestesi dengan inhalasi kloroform dan membunuh tikus dengan cervical dislocation

Pembedahan dan pengambilan darah pada jantung tikus menggunakan spuit

3 cc

Pemeriksaan kadar HDL

 37

4.9 Analisis Data

Data-data yang diperoleh dalam penelitian ini dianalisis menggunakan uji

normalitas, uji homogenitas, uji ANOVA, uji Bonferroni, uji regresi linier yang

diolah menggunakan program SPSS 23 (Statistical Product and Service Solution

versi 23). Uji normalitas dengan uji Saphiro-Wilk karena besar sampel yang

digunakan 50. Data dianggap normal jika hasil p > 0,05. Jika hasil p < 0,05

maka data dapat ditransformasi.

a. Uji homogenitas dengan uji Levene digunakan untuk menentukan varian

data sama atau tidak. Apabila distribusi data normal dan homogen

dilanjutkan dengan uji one way ANOVA.

b. Uji one way ANOVA membuktikan adanya perbedaan yang bermakna

antara kontrol dengan perlakuan dengan perubahan kadar HDL. Hasil uji

ANOVA dikatakan ada perbedaan yang bermakna jika signifikansi (sig)

<0.05

c. Uji post hoc digunakan untuk mengetahui perbedaan yang bermakna

antara masing-masing kelompok perlakuan dalam penelitian. Uji bonferoni

digunakan bila varian sama, bila varian tidak sama digunakan uji gomes

howel.

d. Uji regresi linier untuk mengetahui seberapa kuat pengaruh antara dosis

ekstrak kulit jeruk lemon terhadap kadar HDL.

(Dahlan, 2016)