BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Rancangan Penlitian

Rancangan penelitian yang akan digunakan pada penelitian ini adalah studi
laboratorium eksperimental pada mencit dengan desain penelitian Post Test Only
Control Group Design untuk menilai perbandingan dari ekstrak etanol buah
mengkudu dan tramadol dengan menggunakan hewan coba mencit (Mus
musculus). Mencit dibagi menjadi 7 kelompok yaitu kontrol positif (diberikan
NaCl 0,9%), kelompok pembanding (diberikan tramadol dengan dosis 15
mg/kgBB), dan kelompok uji (diberikan ekstrak etanol buah mengkudu dengan
berbagai macam dosis). Perlakuan yang dilakukan dengan cara diberikan
rangsangan nyeri.

3.2 Objek Penelitian

Objek penelitian ini menggunakan mencit (Mus musculus) strain Swiss-
Webster. Mencit yang digunakan memiliki usia rata-rata 2-3 bulan dengan berat
badan 20-30 gram dan berjenis kelamin jantan. Sebelum dilakukan sebuah
percobaan, hewan ini akan di adaptasikan selama 7 hari di Laboratorium
Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Jenderal Achmad Yani. Mencit
akan diberi makan dan minum dan diberi zat uji coba sesuai kelompok perlakuan.
Mencit diperoleh dari unit perkembangbiakan hewan Institut Teknologi Bandung.
Hewan coba yang akan diberikan perlakuan, memenuhi kriteria sebagai
berikut:
1. Kriteria inklusi
a. Mencit yang sehat.
b. Berat badan 20-30 gram.
c. Usia rata-rata 2-3 bulan.
2. Kriteria eklusi
a. Mencit yang sakit saat masa adaptasi.
b. Mencit yang mati saat masa adaptasi.

22
 23

3. Kriteria drop out

a. Mencit yang sakit saat perlakuan.
b. Mencit yang mati saat perlakuan.

3.3 Jumlah sampel

Jumlah sampel yang digunakan dalam penelitian ini berdasarkan rumus
ferderer adalah 28 ekor mencit (Mus musculus). Sampel dibagi menjadi 7
kelompok dengan perlakuan yang berbeda, satu kelompok terdiri dari 4 mencit.

3.4 Variabel Penelitian

Variabel yang peneliti gunakan terdiri dari dua variabel, yaitu:
1. Variabel bebas: dosis tramadol, dosis ektrak etanol buah mengkudu, dan
waktu pemeriksaan.
2. Variabel terikat: waktu respon nyeri.

3.5 Definisi Operasional

Definisi operasional penelitian adalah sebagai berikut:
1. Respon nyeri merupakan respon menjilat kaki (paw lick) mencit yang
disebabkan oleh rangsangan nyeri berupa panas.
2. Pengobatan tradisional merupakan sarana pengobatan yang telah menjadi
sebuah tradisi atau budaya turun temurun di suatu daerah.
3. Pengobatan modern merupakan sarana pengobatan yang digunakan oleh
para tenaga medis.
4. Obat herbal merupakan obat yang berasal dari tumbuhan-tumbuhan alami.
5. Obat kimia merupakan obat yang berasal dari tumbuhan/binatang dan
diolah secara kimiawi
6. Mengkudu adalah buah yang akan dijadikan ekstrak etanol buah
mengkudu.
7. Ekstrak etanol buah mengkudu adalah sediaan kental yang diperoleh dari
dari buah mengkudu, kemudian direndam dalam etanol dan disaring lalu
dipekatkan menggunakan rotary evaporator atau destilasi.
 24

8. Buah mengkudu pada penelitian ini berasal dari Subang dengan jenis tanah
latosol dan suhu lingkungan 28-29oC.
9. Mencit adalah objek penelitian yang diberikan rangsangan nyeri.
10. Nyeri adalah rangsangan sensoris yang ditimbulkan dari suhu panas
(55oC) sehingga akan terjadi kerusakan jaringan, lalu akan merangsang
nosiseptor sehingga timbul rasa nyeri.
11. Tramadol merupakan obat yang digunakan pada kelompok pemanding
12. Dosis tramadol yang digunakan adalah 15 mg/kgBB.
13. Kontrol positif adalah kelompok mencit yang hanya diberikan NaCl 0,9%.
14. Kelompok pembanding adalah kelompok mencit yang diberikan tramadol.
15. Dosis ektrak etanol buah mengkudu yang diberikan adalah 200 mg/kgBB,
400 mg/kgBB, 600 mg/kgBB, 800 mg.kgBB, dan 1000 mg/kgBB.
16. Kelompok uji adalah kelompok mencit yang diberikan ekstrak etanol buah
mengkudu.
17. Dosis minimal adalah dosis terkecil yang mempunyai efek analgesik.
18. Dosis efektif adalah dosis yang memiliki efek analgesik paling efektif.
19. Dosis maksimal adalah dosis terbesar yang memberikan efek analgesik
tetapi tidak menimbulkan efek samping.
20. Waktu respon adalah lamanya waktu dari saat mencit disimpan di dalam
beker gelas yang sudah dipanaskan hingga menimbulkan respon nyeri.
21. Efek analgesik adalah efek yang didapatkan oleh mencit sehingga waktu
respon nyeri akan melambat (≥30detik).

3.6 Bahan dan Alat/ Instrumen Penelitian

Bahan yang digunakan adalah ekstrak etanol buah mengkudu, obat tramadol,
dan NaCl fisiologis. Buah mengkudu yang digunakan adalah buah yang sudah
berumur 4-5 bulan, yang sudah berwarna putih kekuningan atau putih transparan.
3.6.1 Pembuatan Bahan Penelitian
Pembuatan ekstrak etanol buah mengkudu dilakukan oleh pihak Institut
Teknologi Bandung. Bahan ekstrak berasal dari buah mengkudu yang berada di
daerah Subang, Jawa Barat. Buah ditanam ditanah yang berjenis latosol dan
 25

dengan suhu optimal, yaitu sekitar 28-29oC. Buah mengkudu yang digunakan
adalah buah yang sudah berwarna kuning keputihan (matang). Setelah
mendapatkan buahnya, buah tersebut telah dapat dicuci lalu dihancurkan dengan
blender. Hasil dari penghancuran tersebut, dilarutkan mengguanakan etanol 70%
dan diaduk selama 3 jam. Perbandingan etanol dengan mengkudu adalah 1:1, 2:1,
dan 3:1. Setelah dilakukan penglarutan, hasilnya disaring dengan menggunakan
penyaring vakum. Lalu filtrat dari buah mengkudu akan didapat, kemudian
dipekatkan dengan mengunakan rotasi evaporator dengan suhu 400C hingga filtrat
menjadi pekat.
3.6.2 Alat penelitian
Beberapa peralatan yang diperlukan pada penelitian ini adalah sebagai
berikut: waterbath, timbangan digital, 2 gelas ukur, 30 gelas beker, mortir, 3
sonde oral, kandang mencit, sarung tangan, masker, stopwatch, spatula, akuades,
dan tusuk gigi.

3.7 Prosedur Penelitian

3.7.1 Penentuan Dosis
Ekstrak atau obat yang diberikan pada mencit diencerkan terlebih dahulu.
Ekstrak diberikan 200 mg/kgBB, 400 mg/kgBB, 600 mg/kgBB, 800 mg/kgBB,
dan 1000 mg/kgBB dengan 1000 kali pengecneran. Tramadol diberikan 15
mg/kgBB dengan 10 kali pengenceran (lampiran 3).
3.7.2 Perlakuan Subjek Penelitian
Peneliti mengumpulkan 28 ekor mencit dengan berat badan dan usia yang
telah diketahui. Mencit diadaptasikan selama 7 hari dengan diberikan makanan
(pellet 511) dan minuman (aqudes) serta pastikan kesehatan mencit. Mencit
disimpan di Laboratorium Hewan Fakultas Kedokteran Universitas Jenderal
Achmad Yani. Lalu kelompokan mencit tersebut kedalam 7 kelompok, antara
lain:
Kelompok 1 : Merupakan kelompok kontrol positif yang hanya diberikan NaCl
0.9% lalu diberikan rangsangan nyeri.
 26

Kelompok 2 : Merupakan kelompok pembanding. Saat itu mencit akan

diberikan obat tramadol sebanyak 15 mg/kgBB lalu diberikan
rangsangan nyeri setelah 60 menit pemberian obat.
Kelompok 3 : Kelompok ini diberi perlakuan setelah 7 hari. Saat itu mencit akan
diberikan esktrak etanol buah mengkudu sebanyak 200 mg/kgBB
lalu diberikan rangsangan nyeri setelah 60 menit pemberian
ekstrak.
Kelompok 4 : Kelompok ini diberi perlakuan setelah 7 hari. Saat itu mencit akan
diberikan esktrak etanol buah mengkudu sebanyak 400 mg/kgBB
lalu diberikan rangsangan nyeri setelah 60 menit pemberian
ekstrak.
Kelompok 5 : Kelompok ini diberi perlakuan setelah 7 hari. Saat itu mencit akan
diberikan esktrak etanol buah mengkudu sebanyak 600 mg/kgBB
lalu diberikan rangsangan nyeri setelah 60 menit pemberian
ekstrak.
Kelompok 6 : Kelompok ini diberi perlakuan setelah 7 hari. Saat itu mencit akan
diberikan esktrak etanol buah mengkudu sebanyak 800 mg/kgBB
lalu diberikan rangsangan nyeri setelah 60 menit pemberian
ekstrak.
Kelompok 7 : Kelompok ini diberi perlakuan setelah 7 hari. Saat itu mencit akan
diberikan esktrak etanol buah mengkudu sebanyak 1000
mg/kgBB lalu diberikan rangsangan nyeri setelah 60 menit
pemberian ekstrak.
Setelah diberikan perlakuan pada ketujuh kelompok tersebut, maka peneliti
menghitung waktu respon.
3.7.3 Pengamatan
Mencit diberikan ekstrak etanol buah mengkudu dan tramadol, lalu tunggu
selama 60 menit untuk mengabsorbsinya, Lalu mencit simpan di beker gelas yang
telah diberi identitas. Waterbath dipanaskan dengan suhu 55oC. Kemudian
simpan satu gelas beker diatas waterbath, diamkan hingga panasnya menyebar
keseluruh permukaan gelas. Lalu masukan mencit ke setiap beker gelas yang
 27

sudah diberikan identitasnya. Perhatikan waktu respon, respon yang muncul

adalah respon paw lick (menjilat kaki). Waktu respon diamati selama 60 menit.
Amati respon nyeri yang terjadi pada 10 menit pertama. Ketika waktu respon
nyeri telah timbul catat lalu keluarkan mencitnya dari beker gelas, lakukan hal
tersebut hingga 60 menit.

3.7.4 Alur Penelitian

28 mencit

Adaptasi selama 7 hari

Dibagi menjadi 7 kelompok (masing-masing 5 ekor mencit)

Kelompok uji
Kontrol positif Diberikan ekstrak etanol buah mengkudu
Kontrol negatif Kelompok 1: 200 mg/kgBB
Diberikan
Diberikan NaCl Kelompok 2: 400 mg/kgBB
Tramadol 15
0,9% 0,5ml Kelompok 3: 600 mg/kgBB
mg/kgBB
Kelompok 4: 800 mg/kgBB
Kelompok 5: 1000 mg/kgBB

Ditunggu selama 60 menit

Diberikan rangsangan nyeri

Di amati waktu respon nyeri pada mencit

Analisis data

Kesimpulan
Gambar 3.1 Alur penelitian
 28

3.8 Pengolahan Data dan Analisis Data

3.8.1 Pengolahan Data
Data yang terkumpul diolah secara komputerisasi untuk mengubah data
menjadi informasi. Adapun langkah-langkah dalam pengolahan data dimulai dari :
1. Editing, yaitu memeriksa kebenaran data yang diperlukan
2. Coding, yaitu mengubah data berbentuk kalimat atau huruf menjadi data
angka atau bilangan.
3. Data entry, yaitu memasukkan data hasil pemeriksaan dan pengukuran sampel
ke dalam program komputer.
4. Cleaning, yaitu apabila semua data dari sampel telah selesai dimasukkan,
maka dicek kembali untuk melihat kemungkinan adanya kesalahan atau
ketidak lengkapan, kemudian dilakukan koreksi.
3.8.2 Analisis Data
Analisis univariabel bertujuan untuk menggambarkan karakteristik subjek
penelitian yang meliputi data sifat analgesik berdasarkan waktu respon nyeri yang
disajikan dalam rerata, standar deviasi, median, minimum, dan maksimum.
Uji normalitas perlu dilakukan sebelum analisis bivariabel. Uji normalitas
yang digunakan adalah Shapiro Wilks test karena besar sampel kurang dari 50
sampel. Uji normalitas dapat dinyatakan berdistribusi normal bila nilai p>0,05.
Analasis homogenitas perlu dilakukan menggunakan Levene test untuk
mengetahui homogenitas dari data yang diolah. Apabila data tidak homogen maka
dapat dilakukan transformasi data agar data menjadi homogen.
Analisis bivariabel yang bertujuan untuk menguji perbedaan efektifitas
analgesik ektrak etanol buah mengkudu dengan obat tramadol pada mencit yang
diinduksi dengan rangsangan nyeri terhadap waktu respon nyeri digunakan
ANOVA Test bila data waktu respon nyeri berdistribusi normal dan Kruskall
Wallist test bila data tidak berdistribusi normal. Jika terdapat perbedaan
bermakna berdasarkan ANOVA Test maka dilanjutkan dengan Post Hoc LSD test
untuk mengetahui dosis minimal dan dosis maksimal dari ekstrak etanol buah
mengkudu, apabila tidak terdapat perbedaan bermakna pada data, maka dilakukan
dengan pengolahan data menggunakan Kruskall Wallis Test. Jika terdapat
 29

perbedaan bermakna berdasarkan Kruskall Wallis Test maka dilanjutkan dengan

Mann Whitney Test.
Analisis data dilakukan dengan menggunakan program Statistical Product and
Service Solution (SPSS) for windows versi 20.0 pada derajat kepercayaan 95%
dengan nilai p ≤ 0,05.

3.9 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini akan dilakukan di laboratorium Farmakologi Fakultas
Kedokteran Universitas Jenderal Achmad Yani pada bulan September 2015–
Januari 2016.

3.10 Aspek Etika Penelitian

Acuan pedoman etik dalam penelitian ini adalah The Declaration of Helsinki,
Ethical Principles for Medical Research Involving Human Subject yang
diterbitkan oleh World Medical Assosiation dalam General Assembly di Helsinki
tahun 1964. Pedoman etik ini berisi mengenai prinsip perlakuan yang manusiawi
dalam memperlakukan hewan percobaan. Berdasarkan hal tersebut maka
penggunaan hewan coba harus menggunakan prinsip 3R yaitu Replacement
(penggantian), Reduction (pengurangan), dan Refinement (penyempurnaan).
Replacement mencakup metode yang digunakan untuk tidak menggunakan
hewan sebagai tujuan percobaan. Replacement terdiri dari relative (mengganti
organ hewan percobaan dengan organ hewan yang memiliki ordo yang lebih
rendah), dan absolute (mengganti kultur jaringan atau sel pada hewan prcobaan
dengan perangkat computer).pada penelitian ini. Reduction adalah meminimalisir
jumlah hewan coba yang diberi perlakuan tetapi tetap mendapatkan hasil yang
optimal. Jumlah hewan didapatkan berdasarkan rumus ferderer. Refinement adalah
memperlakukan hewan dengan baik, melakukan pemeliharaan yang baik, dan
menimalisir rasa sakit yang akan diterima oleh hewan percobaan saat melakukan
tindakan. Pemeliharaan sesuai karakteristik biologik, karakterisktik spesies yang
digunakan. sehingga meningkatkan kesejahteraan hewan coba.
 30

Penelitian yang menggunakan hewan coba harus memperhatikan 5 prinsip

freedom dengan rincian sebagai berikut: freedom from hunger and thirst (bebas
dari rasa lapar dan haus). freedom from discomfort (bebas dari ketidaknyamanan).
Freedom from pain, injury and disease (bebas dari rasa nyeri, trauma dan
penyakit), Freedom from fear and distress (bebas dari ketakutan dan stress jangka
panjang). Freedom to express natural behavior (bebas mengeksprsikan tingkah
laku alami), Penerapan prinsip - prinsip ini diterapkan sebagai Standar Operating
Procedure terhadap perlakuan peniliti terhadap objek penelitiannya.
Penelitian ini akan diajukan kepada Komisi Etik Penelitian Kesehatan
Fakultas Kedokteran Universitas Padjajaran untuk mendapatkan perizinan
penelitian. Rangkaian perizinan etik diperoleh dengan cara terlebih dahulu
melakukan registrasi, mengajukan proposal penelitian yang selanjutnya akan
ditelaah oleh pihak komisi etik kemudian melakukan perbaikan makalah sesuai
dengan saran komisi etik tersebut.

3.11 Jadwal Penelitian

Jadwal penelitian dimulai dari penetapan judul sampai dengan sidang skripsi,
seperti pada tabel berikut:

Tabel 3.1 Jadwal penelitian

2015 2016
Kegiatan
4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3
Penetapan judul
Penyusunan
proposal
Bimbingan
Persiapan uji
pendahuluan
Adaptasi
mencit 7 hari
Uji
pendahuluan
Seminar
proposal
penelitian
Persiapan
 31

penelitian
2015 2016
Kegiatan
4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3
Mengajukan
penelitian ke
komisi etik
Penelitian
Penyusunan
Skripsi
Sidang skripsi