BAB III

METODE PENELITIAN

A. Materi dan Bahan

1. Bahan Biologis Tersimpan (BBT)

Peneliti mendapatkan preparat jaringan lambung dari hasil penelitian

sebelumnya dalam bentuk BBT (Bahan Biologis Tersimpan), dimana

jaringan lambung telah diproses dalam bentuk preparat blok parafin.

Setelah melalui proses pemotongan jaringan dan pewarnaan dengan HE

(Hematoksilin Eosin), blok-blok parafin tersebut menjadi preparat sediaan

yang kemudian diletakkan pada objectglass. Selanjutnya peneliti

melakukan pengamatan preparat sediaan di bawah mikroskop untuk

mengetahui gambaran histopatologis lambung tikus Wistar.

Bahan Biologis Tersimpan ini diperoleh dari penelitian sebelumnya.

Pada penelitian tersebut, digunakan sejumlah 25 ekor hewan coba tikus

putih (Rattus norvegicus) jantan galur Wistar. Berat badan tikus Wistar

tersebut berkisar 120 – 250 gram, berumur 8 – 12 minggu, sehat jasmani

(mata jernih, bulu bersih, tanpa kelainan anatomi), dan bertingkah laku

normal. Hewan coba didapatkan dari Laboratorium Farmakologi dan

Hewan Coba FK UNSOED. Kandang tikus hewan coba terbuat dari

material kedap air, kuat, dan mudah dibersihkan. Luas area minimal

kandang tikus per ekor dengan berat 100 – 200 g adalah 148,8 cm2 x 17,8

cm (BPOM, 2014).

Berdasarkan panduan Organisation for Economic Co-operation

Development (OECD) (2001) penggunaan untuk kriteria inklusi, eksklusi,

31
 32

dan besar sampel untuk uji toksisitas akut dengan metode oral adalah

sebagai berikut:

a. Kriteria Inklusi:

1) Tikus jenis kelamin jantan

2) Usia 8 – 12 minggu

3) Berat badan diantara 120 – 250 gram

b. Kriteria Eksklusi:

1) Sakit selama aklimatisasi

2) Berat badan meningkat atau menurun sebesar 10% setelah masa

aklimatisasi

c. Besar Sampel

Penelitian ini menggunakan 5 kelompok yaitu kelompok A, B,

C, D, E. Penentuan jumlah sampel hewan coba ditentukan berdasarkan

rumus Federer yaitu:

(n-1) (t-1) ≥ 15

Keterangan : t = banyaknya kelompok

n = banyaknya hewan coba tiap kelompok

Sampel dibagi menjadi 5 kelompok, sehingga :

(n-1) (5-1) ≥ 15

4n – 4 ≥ 15

4n ≥ 19

n ≥ 4,75

Berdasarkan perhitungan tersebut didapatkan hasil 4,75

sehingga peneliti mengambil angka 5 sebagai jumlah sampel pada tiap

 33

kelompok. Total hewan coba yang digunakan dalam penelitian ini

yaitu 5 × 5 = 25 ekor.

2. Alat dan Bahan

a. Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah sarung tangan

Sensi, kontainer plastik, gelas ukur 500 ml, mikrotom, waterbath,

inkubator, objectglass, coverglass, permount, mikroskop cahaya, dan

pewarna Hematoksilin Eosin (HE).

b. Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu blok parafin

yang berisi organ lambung tikus Wistar, alkohol dengan konsentrasi

95%, larutan xylene, larutan Harris Hematoksilin, larutan asam

alkohol, larutan eosin Y dan akuades.

B. Metode Penelitian

Penelitian ini dilakukan dengan memeriksa sejumlah 25 sampel blok

parafin jaringan lambung hewan coba. Blok parafin yang telah diproses

menjadi preparat sediaan lalu dikelompokkan sesuai dengan kelompok

sampel yaitu kelompok kontrol (kelompok A) dan kelompok perlakuan

(kelompok B, C, D, E). Pengamatan dilakukan dengan cara mengamati

preparat sediaan menggunakan mikroskop cahaya dengan perbesaran 400x.

Pengamatan tersebut dilakukan untuk memeriksa integritas mukosanya dan

tanda-tanda peradangan sesuai dengan kriteria dalam skoring Barthel Manja.

Tingkat kerusakan untuk satu sampel tikus didapat dari rerata lima lapangan

pandang. Pengambilan data pada penelitian ini dilakukan setelah intervensi

 34

pada subjek penelitian yaitu pemberian sari markisa ungu berbagai dosis,

sehingga penelitian analitik ekperimental ini menggunakan desain post test

only with control group.

C. Rancangan Penelitian

25 sampel tikus Wistar pada penelitian sebelumnya dibagi menjadi lima

kelompok yang masing-masing berisi lima ekor tikus, yaitu kelompok A

sebagai kontrol dan kelompok B, C, D, E sebagai kelompok perlakuan.

Hewan dimasukkan kedalam kandang sesuai dengan kelompok. Perlakuan

pada hewan coba masing masing kelompok adalah sebagai berikut.

1. Kelompok A

Hewan coba diberikan aquades secara oral.

2. Kelompok B

Hewan coba diberikan sari markisa ungu dosis 4,2 ml/200gBB/hari.

3. Kelompok C

Hewan coba diberikan sari markisa ungu dosis 8,4 ml/200gBB/hari.

4. Kelompok D

Hewan coba diberikan sari markisa ungu dosis 12,6 ml/200gBB/hari.

5. Kelompok E

Hewan coba diberikan sari markisa ungu dosis 16,8 ml/200gBB/hari.

Data integritas mukosa lambung pada penelitian ini diperoleh

berdasarkan skoring Barthel Manja yang mengelompokkan kerusakan

lambung menjadi normal, deskuamasi epitel, erosi epitel, dan ulkus epitel.

Hasil skor dalam 5 lapang pandang diolah ke dalam tabel untuk ditentukan

rerata tiap sampel. Setelah diperoleh rerata setiap sampel, kemudian

 35

ditentukan rerata setiap kelompok sampel. Skor yang didapat kemudian

diolah dengan menggunakan perangkat lunak SPSS untuk mengetahui apakah

terdapat perbedaan yang signifikan antar kelompok setelah pemberian sari

markisa ungu berbagai dosis.

D. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional

Variabel penelitian terdiri dari variabel independen dan variabel

dependen. Variabel independen dari penelitian ini adalah sari markisa ungu

dan variabel dependen penelitian ini adalah gambaran histopatologis

lambung.

Tabel 3.1. Daftar Variabel yang Diukur pada Penelitian

Definisi Skala
Variabel Nilai
Operasional Data
Variabel Histopato- Untuk memeriksa 0: normal Numerik
dependen logis gambaran histopato- 1: deskuamasi rasio
lambung logis lambung tikus epitel
putih (Rattus norve- 2: erosi epitel
gicus) galur Wistar, 3: ulkus epitel
diperoleh dengan
membuat preparat
dengan pengecatan
Hematoksilin Eosin
(HE). Preparat
tersebut diamati
dengan mikroskop
cahaya untuk
diperiksa integritas
mukosanya. Tingkat
kerusakan untuk satu
tikus didapat dari
rerata lima lapangan
pandang.
Variabel Dosis sari Sari markisa ungu 1. 4,2 Numerik
independen markisa adalah markisa yang ml/200g rasio
ungu dipotong kemudian BB/hari
(Passiflora diperas dengan kain 2. 2 x 4,2
edulis var saring untuk diambil ml/200g
edulis) sarinya. Pemberian BB/hari
 36

secara oral dengan 3. 3 x 4,2

menggunakan sonde ml/200g
lambung pada hewan BB/har
coba tikus putih 4. 4 x 4,2
(Rattus norvegicus) ml/200g
galur Wistar BB/hari

E. Cara pengukuran Variabel

Pengukuran variabel terikat, gambaran histopatologis lambung, dapat

diamati dengan mikroskop. Hasil gambaran histopatologis lambung dapat

diinterpretasikan dengan skoring Barthel Manja yang mengelompokkan

kerusakan lambung menjadi normal, deskuamasi epitel, erosi epitel, dan ulkus

epitel. Gambaran normal dan deskuamasi diasosiasikan sebagai kerusakan

ringan, sedangkan adanya erosi dan ulkus diasosiasikan dengan kerusakan

berat.

Tabel 3.2 Sistem Skor berdasarkan Modifikasi Skoring Barthel Manja

Skor Integritas Epitel Mukosa

Skor 0 : Normal (Tidak ada perubahan patologis)
Skor 1 : Deskuamasi epitel lambung
Skor 2 : Erosi epitel lambung (celah 1-10 sel epitel / lesi)
Skor 3 : Ulkus epitel lambung (celah >10 sel epitel / lesi)
Sumber: (Manja et al., 2003).

Perhitungan skor kerusakan lambung juga dapat dinilai berdasarkan ada

tidaknya edema di lapisan submukosa gaster, ada tidaknya infiltrasi sel PMN

(polimorfonuklear) di lamina propia gaster, dan integritas epitel di lapisan

mukosa gaster (Utami et al., 2018). Gambaran kerusakan histopatologis

lambung tikus juga dapat berupa infiltrasi sel yang terdiri dari limfosit,

neutrofil, eosinofil, dan sel khas mononuklear. Infiltrasi sel dan ekstravasasi
 37

cairan di tempat peradangan disebabkan oleh pelepasan histamin, serotonin,

dan prostaglandin (Yonezawa et al., 2019).

F. Tata Urutan Kerja

1. Pembuatan preparat sediaan organ lambung

a. Pemotongan Jaringan

Blok parafin yang telah didapat dari penelitian sebelumnya akan

dipotong sehingga menjadi tipis. Alat yang digunakan untuk

memotong jaringan adalah mikrotom. Pemotongan jaringan dilakukan

dengan ketebalan potongan 5 mikron. Setelah dipotong, jaringan

dimasukkan ke dalam waterbath 37-40 °C sampai meregang. Jaringan

diletakkan di atas objectglass dan dimasukkan ke dalam inkubator

dengan suhu 37 °C selama 24 jam hingga jaringan melekat sempurna.

b. Pewarnaan Hematoksilin Eosin (HE)

Preparat direndam dalam xylene untuk deparafinisasi selama lima

menit sebanyak dua kali, kemudian masukkan ke dalam alkohol

absolut lima menit sebanyak dua kali. Lalu masukkan ke alkohol 95%

selama lima menit sebanyak dua kali dan dibilas dengan aquades

selama tiga menit kemudian dikeringkan. Preparat dimasukkan ke

dalam larutan Harris Hematoksilin selama tiga sampai lima menit dan

dibilas dengan aquades selama tiga menit dan asam alkohol selama 2

detik. Preparat dimasukkan pada larutan Eosin Y selama dua sampai

lima menit kemudian bilas dengan aquades selama 30 detik. Preparat

direndam dalam alkohol 95% selama dua menit sebanyak dua kali dan
 38

alkohol absolut selama dua menit sebanyak dua kali. Preparat dioles

dengan permount dan ditutup dengan coverglass.

2. Dokumentasi

Dokumentasi data dilakukan dengan pengamatan dan pencatatan

hasil gambaran histopatologis lambung tikus Wistar setelah pemberian

sari markisa ungu.

3. Pengolahan dan analisis data

Pengolahan dan analisis data hasil penelitian dilakukan dengan

menggunakan perangkat lunak statistik pada komputer yaitu Statistical

Package fir Social Sciences (SPSS).

G. Analisis Data

Analisis univariat disajikan dengan statistik deskriptif terhadap

variabel-variabel yang diukur. Analisis data pada penelitian ini dilakukan

secara kualitatif terhadap hasil pengamatan, yaitu skor integritas mukosa

lambung dan variabel bebas sari markisa ungu. Hasil analisis dicantumkan

dalam bentuk rerata dan simpangan baku.

Distribusi data dinilai dengan uji normalitas (uji Shapiro-Wilk) karena

sampel berjumlah 25 ekor tikus (<50 sampel data) dan dilanjutkan uji

homogenitas dengan uji Levene. Data diperoleh tidak terdistribusi normal dan

data tidak homogen (p<0,05) sehingga data dilakukan transformasi terlebih

dahulu dengan SQRT. Data hasil transformasi data tetap tidak menunjukkan

data berdistribusi normal dan homogen sehinga dilakukan uji non parametrik

Kruskal-Wallis. Berdasarkan hasil analisis bivariat, data dinyatakan tidak

 39

bermakna (p>0,05) sehingga tidak dilakukan uji Post Hoc dengan Mann

Whitney (Dahlan, 2013).

H. Waktu dan Tempat

1. Waktu

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan September 2020 hingga Januari

2021.

2. Tempat

Pengamatan sediaan preparat lambung secara mikroskopis dilakukan di

Laboratorium Patologi Anatomi FK UNSOED.