11

BAB 3 MATERI DAN METODE

3.1 Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratorium post test

only control group design. Rancangan penelitian yang digunakan adalah

Rancangan Acak Lengkap (RAL) karena hanya terdapat satu keragaman yaitu

perlakuan menggunakan serum katak muda berekor (Rana catesbeiana) dengan

berbagai konsentrasi dengan ulangan sebanyak empat kali (Kusriningrum, 2010).

3.2 Sampel dan Besar Sampel

3.2.1 Sampel Penelitian

Sampel penelitian yang digunakan selama penelitian adalah tikus

putih (Rattus norvegicus) galur Sprague-Dawley dengan jenis kelamin

jantan, umur 8-10 minggu, berat badan 150-250 gram dan tidak ada

abnormalitas anatomis. Tikus putih (Rattus norvegicus) berasal dari UD.

Tiput Abadi Jaya Peternakan Hewan Uji, Yogyakarta dengan sertifikat

sehat.

3.2.2 Besar Sampel Penelitian

Besar sampel penelitian yang digunakan selama penelitian

ditentukan dengan menggunakan rumus Federer (Kusriningrum, 2010) :

t (n-1) 15
Keterangan : n = Jumlah pengulangan atau besar sampel dalam
kelompok.
t = Jumlah perlakuan atau banyaknya kelompok (Lima
kelompok).
 12

t(n-1) 15

5(n-1) 15

5n 15 + 5

n 20/5

n 4

Dari rumus diatas, didapatkan jumlah ulangan minimal empat ekor tikus

putih (Rattus norvegicus), dan untuk penelitian ini menggunakan lima

kelompok perlakuan dan secara keseluruhan membutuhkan 20 ekor tikus.

Sebanyak 20 ekor tikus putih (Rattus norvegicus) dibagi secara acak

menjadi 5 kelompok perlakuan sebagai berikut :

K+ : Kelompok kontrol positif. Hewan coba pada kelompok ini

selama perlakuan hanya diberi pakan standart dan air minum.

K- : Kelompok kontrol negatif. Hewan coba diinduksi DMBA dan

diterapi 100% NaCl 0,9% sebanyak 1,06 ml.

P1 : Kelompok perlakuan satu. Hewan coba diinduksi DMBA dan

diterapi serum katak muda berekor 1,06 ml (100% serum).

P2 : Kelompok perlakuan dua. Hewan coba diinduksi DMBA dan

diterapi serum katak muda berekor 1,06 ml (75% serum + 25%

NaCl 0,9%).

P3 : Kelompok perlakuan tiga. Hewan coba diinduksi DMBA dan

diterapi serum katak muda berekor 1,06 ml (25% serum + 75%

NaCl 0,9%).
 13

3.3 Peubah atau Variabel yang Diamati

3.3.1 Variabel Bebas

Variabel bebas dalam penelitian ini adalah serum katak muda berekor

(Rana catesbeina).

3.3.2 Variabel Terikat

Variabel terikat dalam penelitian ini adalah perubahan nilai eritrosit,

nilai leukosit, hemoglobin, dan hematokrit tikus putih (Rattus norvegicus)

sebelum dan sesudah diberi perlakuan.

3.3.3 Variabel Terkendali

Variabel terkendali dalam penelitian ini adalah tentang informasi

tikus putih yang berkaitan dengan : jenis kelamin, pakan, minuman, berat

badan, umur, suhu, kandang, litter atau alas kandang, pemberin induksi

kanker pada K-, P1, P2, dan P3, serta minyak jagung sebagai pelarut DMBA

dan PZ atau NaCL 0,9%.

3.4 Definisi Operasional Variabel

3.4.1 Serum Katak

Serum katak muda berekor (Rana catesbeiana) adalah serum yang

diambil dari Rana catesbeiana. Pengambilan serum menggunakan

disposable syringe 1ml with tuberculin needle secara intra cardia pada katak

muda berekor (Rana catesbeiana).

 14

3.4.2 Eritrosit

Eritrosit adalah sel darah merah yang paling banyak dan mengandung

hemoglobin yang berfungsi mengikat oksigen dan mengedarkannya ke

seluruh tubuh.

3.4.3 Leukosit

Leukosit berperan sebagai salah satu komponen kekebalan tubuh yang

berperan melakukan fagositosis. Perhitungan nilai total leukosit dilakukan

dengan menghitung semua sel leukosit. Hitung jenis leukosit menyatakan

bahwa persentase berbagai jenis leukosit yang terdapat di dalam darah

(Bijanti dkk, 2010).

3.4.4 Hematokrit

Hematokrit adalah nilai persentase volume darah yang mengandung

sel darah merah, selain itu nilai hematokrit dipengaruhi oleh jumlah dan

ukuran sel darah merah (Duka dkk, 2015).

3.5 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Program Studi Pendidikan Dokter

Hewan PSDKU Universitas Airlangga di Banyuwangi, serta Laboratorium

Patologi Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga Surabaya untuk

pembacaan tes darah menggunakan Hematology Analyzer. Penelitian dilakukan

selama bulan November 2016 Januari 2017.

3.6 Bahan dan Materi Penelitian

 15

3.6.1 Bahan Penelitian

a. Hewan Percobaan

Hewan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah

tikus putih (Rattus norvegicus) galur Sprague-Dawley dengan jenis

kelamin jantan sebanyak 20 ekor yang diperoleh dari UD Tiput Abadi

Jaya Peternakan Hewan Uji, Yogyakarta. Tikus putih (Rattus

norvegicus) memiliki umur 8-10 minggu dan berat badan 150-250

gram.

b. Induksi Kanker DMBA dan Bahan Penunjang

Bahan untuk pemicu kanker yang digunakan dalam penelitian

ini adalah DMBA (7,12-Dimethylbenz--anthrance) yang dilarutkan

dalam minyak jagung. Injeksi DMBA (7,12-Dimethylbenz---

anthrance) menggunakan disposable syringe 1ml with tuberculin

needle dan kapas steril beserta alkohol 70%.

c. Serum Katak Muda Berekor dan Bahan Penunjang
Pengambilan darah katak muda berekor (Rana catesbeiana)

menggunakan disposable syringe 1ml with tuberculin needle. Darah

ditampung menggunakan tabung EDTA tanpa antikoagulan. Tabung

diselimuti dengan aluminium foil dan disentrifus. Pengenceran serum

menggunakan PZ atau NaCL fisiologis 0,9% kemudian diinjeksikan

pada tikus putih (Rattus norvegicus) dengan menggunakan disposable

syringe 1ml with tuberculin needle.

3.6.2 Alat Penelitian

Alat yang digunakan dalam Penelitian ini adalah penimbang berat

badan tikus, kandang tikus, tempat minum, tempat pakan, litter atau alas
 16

kandang dari serbuk kayu, disposable syringe 1ml with tuberculin needle,

gelas beaker 100ml, gelas ukur 100 ml, timbangan analitik, kertas saring,

dan kamera.

3.7 Prosedur Penelitian

3.7.1 Uji Kode Etik

Persiapan awal yang dilakukan sebelum melakukan penelitian adalah

dengan melakukan uji kode etik hewan coba yang dilaksanakan di Fakultas

Kedokteran Hewan Universitas Airlangga, Surabaya agar penelitian berjalan

sesuai kaidah animal welfare dan prosedur penelitian.

3.7.2 Persiapan Alat dan Bahan
Tikus putih (Rattus norvegicus) galur Sprague-Dawley didapatkan

dari budidaya tikus penelitian di UD. Tiput Abadi Jaya Peternakan Hewan

Uji, Yogyakarta yang telah bersertifikat sehat dengan spesifikasi jenis

kelamin jantan, sehat dan tidak cacat. Tikus putih (Rattus norvegicus)

diadaptasikan selama tujuh hari. Adaptasi dilakukan dengan tujuan agar

dapat menyesuaikan dengan lingkungan yang baru, pakan, minum, kendang

serta peneliti. Katak muda berekor (Rana catesbeiana) didapatkan dari

budidaya katak bullfrog atau lembu (Rana catesbeiana) di Lamongan.

Peralatan yang digunakan seperti kandang, litter atau alas kandang, tempat

pakan, tempat minum, pakan, serta air minum di perlakukan sama setiap

kelompok perlakuan.
3.7.3 Induksi Kanker
Pengenceran DMBA (7,12-Dimethylbenz--anthrance) dilakukan

sebelum melakukan induksi kanker. Pengenceran dilakukan menggunakan

minyak jagung. Minyak jagung berfungsi sebagai pelarut dari DMBA (7,12-
 17

Dimethylbenz--anthrance). Dosis untuk induksi DMBA (7,12-

Dimethylbenz--anthrance) sebagai pemicu untuk memunculkan sel kanker

sebanyak 20 mg/kg BB (Cabecas et al, 2014). Induksi DMBA (7,12-

Dimethylbenz--anthrance) untuk memunculkan atau menimbulkan sel

kanker disuntikkan atau diinduksikan secara sub cutan dengan

menggunakan needle ukuran 16G. Bubuk DMBA (7,12-Dimethylbenz--

anthrance) dilarutkan terlebih dahulu dengan minyak jagung dengan tujuan

untuk mempermudah proses induksi. Perbandingan bubuk DMBA (7,12-

Dimethylbenz--anthrance) dengan minyak jagung adalah 1ml minyak

jagung mengandung 20 mg DMBA (7,12-Dimethylbenz--anthrance).

Induksi dilakukan selama 2,5 minggu dengan durasi pemberian dua kali

seminggu. Induksi kanker dilakukan secara sub cutan pada bagian tengkuk

tikus putih (Rattus norvegicus).

Pengamatan kanker dilakukan setelah injeksi pertama DMBA (7,12-

Dimethylbenz--anthrance) dengan cara palpasi bagian injeksi atau tengkuk

dan kulit bagian lain dari tikus putih (Rattus norvegicus). Pengamatan

kanker dilakukan juga pengukuran diameter dan jumlah nodul yang timbul.

Nodul yang timbul diharapkan adalah nodul kanker bukan merupakan nodul

abses. Palpasi dan pengukuran dilakukan setiap hari.

3.7.4 Pengambilan Serum Katak Muda Berekor
Pengambilan serum katak muda berekor (Rana catesbeiana)

dilakukan secara intra cardia menggunakan disposable syringe 1ml with

tuberculin needle. Darah yang telah diambil lalu dimasukkan ke dalam

tabung EDTA tanpa antikoagulan yang ditutup dengan aluminium foil agar

mencegah serum terkena sinar ultraviolet secara langsung. Darah disentrifus

 18

dengan kecepatan 1000rpm selama 15 menit. Hasil dari sentrifus diinkubasi

kedalam freezer selama 12 jam. Serum di thawing selama 5-10 menit

terlebih dahulu sebelum digunakan.

3.7.5 Pemberian Serum
Pemberian serum katak muda berekor (Rana catesbeiana) dilakukan

secara sub cutan pada perlakuan satu (P1), perlakuan dua (P2) dan

perlakuan tiga (P3). Pemberian serum dilakukan sebanyak sehari sekali

selama tujuh hari atau satu minggu. Dosis terapi tiroksin menurut

Provinciali dan Fabris (1990) adalah 0,01-0,1 mikrogram/ml, sedangkan

kandungan tiroksin didalam serum katak muda berekor (Rana catesbeiana)

adalah 9,4 ng/ml (Mondau dan Kaltenbach, 1979). Sesuai dosis terapi, maka

pemberian terapi serum untuk hewan coba pada perlakuan satu (P1)

sebanyak 1,06 ml/ekor/hari, perlakuan dua (P2) sebanyak 0,71 ml/ekor/hari

dengan penambahan PZ atau NaCl fisiologis 0,9% sebanyak 0,35

ml/ekor/hari dan perlakuan tiga (P3) sebanyak 0,27 ml/ekor/hari dengan

penambahan PZ atau NaCl fisiologis 0,9% sebanyak 0,79 ml/ekor/hari. Pada

kontrol negatif (K-) hanya diberikan PZ atau NaCL fisiologi 0,9% sebanyak

1,06 ml/ekor/hari. Pada kontrol positif (K+) tidak diberi serum ataupun PZ

atau NaCl fisiologis 0,9%.

3.7.6 Pengambilan Sampel Darah
Pengambilan sampel darah dilakukan melalui jantung (Cardiac

puncture) menggunakan disposable syringe 3 ml sebanyak 2 ml pada tikus

dihari ke-25 dan ke-39. Darah kemudian ditampung di dalam tabung reaksi

yang telah diberi antikoagulan EDTA agar tidak mempengaruhi besar dan
 19

bentuk dari eritrosit maupun bentuk dari leukosit (Bijanti dkk 2010). Darah

segera dihitung dan di periksa.

3.7.7 Pemeriksaan Darah
Pemeriksaan darah menggunakan alat Hematology Analyzer XT

2000i dan dihubungkan dengan perangkat komputer. Darah terlebih dahulu

dihomogenkan terlebih dahulu menggunakan Roller-Mixer selama 1-2

menit sebelum diperiksa menggunakan Hematology Analyzer. Darah akan

dihisap secara otomatis oleh pipet dari Hematology Analyzer, dan data akan

ditampilkan di layar komputer.

3.8 Analisis Data

Data yang diperoleh dalam bentuk nilai jumlah eritrosi, leukosit, trombosit,

kadar hematokrit, dan hemoglobin hewan coba disusun dalam bentuk tabel atau

ditabulasikan yang kemudian dianalisis menggunakan uji statistik ANOVA

Analysis of Variant. Apabila terdapat adanya perbedaan antar perlakuan akan

dilanjutkan dengan uji Jarak Berganda Duncan dengan taraf signifikansi sebesar

5% (p<0,05). Analisis data dilakukan menggunakan SPSS (Statistical Program

for Social Science) 20.0 for Windows.

 20

3.9 Diagram Alir Penelitian

UJI ETIK

ADAPTASI
HEWAN
COBA

K+ K- K- K-
Tanpa Induksi Induksi Kanker P1 Induksi Kanker Induksi Kanker
Kanker Induksi Kanker

K+ K- Gambar 3.1P1Diagram Alir P2 P3

Tanpa Terapi Terapi 100% Pemeriksaan
Analisis
Terapi Serum
PENGAMBILAN
PENGAMBILAN Terapi Serum Terapi Serum
NaCl 0,9% Sampel
Data
100%
DARAH
DARAH 75% 50%