28

BAB 4 METODE PENELITIAN

4.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini akan dilaksanakan pada bulan Juli-Agustus 2018. Penelitian

dilakukan Laboratorium Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya

dan Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Hewan Universitas

Brawijaya. Pengujian flow cytometry dilakukan di Fakultas MIPA (Matematika dan

Ilmu Pengetahuan Alam) Universitas Brawijaya.

4.2 Alat dan Bahan

4.2.1 Alat

Alat pemeliharaan hewan coba terdiri dari kandang dari kotak plastik

dengan ukuran 35 x 27,5 x 12 cm, tutup kandang dari anyaman kawat, botol air,

rak besi sebagai tempat meletakkan kandang, cctv untuk memantau kegiatan tikus

selama di kandang. Alat untuk pemeriksaan diabetes melitus terdiri dari spuit 1 cc

One Med, pengukur gula darah (Gluko-Dr®), timbangan, pot sampel sebagai

tempat streptozotocin, lap steril untuk memudahkan handling hewan coba, dan

spidol untuk memberi tanda pada tikus dalam setiap kandang. Alat untuk

membuat suspensi bakteri Stapylococcus aureus terdiri dari cawan petri, tabung

reaksi, gelas ukur, Erlenmeyer, rak tabung reaksi, ose bulat, ose lurus, kapas,

aluminium foil, autoklaf, bunsen, masker, glove, plastic wrap, sprayer alcohol,

ice box, ice gel, inkubator, laminar air flow, sentrifugator, dan mikropipet serta

yellow tip. Alat untuk pemeriksaan dan pembedahan tikus terdiri dari termometer,

stetoskop, gunting tajam-tumpul, gunting tajam-tajam, scaple dan blade, pinset

 29

anatomis, pinset sirugis, pot sample, spuit 1 ml, spuit 3 ml, tabung vacuntainer

EDTA dan serum, papan pembedah hewan, dan tabung falcon. Preparasi organ

limpa untuk uji flow cytometry membutuhkan alat yang terdiri dari cawan petri,

spuit 3 ml, yellow tip, tabung ependof, sentrifuge tube, rak ependof, masker, glove,

tisuue, sentrifuge, dan ice box beserta ice gel. Sedangkan alat pada pengujian flow

cytometry terdiri dari kuvet, ependorf, BD FACS CaliburTM flowcytometer, Micro

tube 1,5 mL, FCM tube, dan mikropipet.

4.2.2 Bahan

Bahan persiapan hewan coba terdiri dari tikus putih (Rattus novergicus)

jantan galur wistar dengan berat 150-250 gr, Alkohol 70 %, pakan tikus, air,

aquades, kit diabetes melitus, dan serbuk gergaji sebagai alas kandang tikus.

Bahan preparasi bakteri Stapylococcus aureus terdiri dari Mannitol Salt Agar

(MSA), Nutrient Agar Plate (NAP), Nutrient Broth (NB), aquades steril,alkohol

70%, Standart Mc Farland 0,5, sterile phosphate-buffered saline (PBS). Bahan

Pembedahan dan preparasi untuk flowcytometry pada organ limpa tikus setelah

diberikan perlakuan terdiri dari alkohol 70%, NaCL fisiologis, sterile phosphate-

buffered saline (PBS), dan formalin. Bahan pengujian flowcytometry terdiri dari

PBS steril, antibodi ektraseluler staining NF-KB dan SOD.

4.3 Tahapan Penelitian

1) Persiapan hewan coba

2) Induksi Single High Dose streptozotosin

3) Induksi Staphylococcus aureus

4) Nekropsi dan preparasi organ limpa

 30

5) Menentukan kadar SOD dan NF-KB

6) Analisis data

4.4 Prosedur Kerja

4.4.1 Rancangan Penelitian

Penelitian ini adalah penelitian bersifat eksperimental menggunakan

Rancangan Acak Lengkap (RAL). Hewan coba dibagi menjadi lima kelompok

perlakuan yaitu K(-) adalah tikus yang tidak diberi perlakuan (kontrol negatif),

K(+) adalah tikus yang diinduksi Staphylococcus aureus 108 CFU/mL (kontrol

positif infeksi Staphylococcus aureus), P1 adalah tikus yang diinduksi

streptozotosin 45 mg/kg BB dan Staphylococcus aureus 105 CFU/mL, P2 adalah

kelompok adalah tikus yang diinduksi streptozotosin 45 mg/kg BB dan

Staphylococcus aureus 106 CFU/mL, dan P3 adalah kelompok tikus yang

diinduksi adalah tikus yang diinduksi streptozotosin 45 mg/kg BB dan

Staphylococcus aureus 107 CFU/mL (Lampiran 2). Banyaknya ulangan yang

digunakan berdasarkan rumus Federer (Supranto, 2007):

Jumlah ulangan = t ( n-1) ≥ 15

5 (n-1) ≥ 15

5n – 5 ≥ 15

5n ≥ 20

n ≥4

n ≥4

Keterangan : t = jumlah kelompok

n = jumlah ulangan yang diperlukan

 31

Berdasarkan perhitungan di atas, maka untuk empat kelompok perlakuan

dan satu kelompok kontrol diperlukan jumlah ulangan sebanyak empat kali dalam

setiap kelompok sehingga dibutuhkan 20 ekor hewan coba.

Tabel 4.1. Rancangan Penelitian “One Way Table”

Ulangan
Perlakuan Total Rata-rata
1 2 3 4
K(-)
K(+)
P1
P2
P3

Keterangan:

K- = Kontrol negatif

K+ = Tikus diinduksi Staphylococcus aureus 108 CFU/mL

P1 = Tikus diinduksi streptozotosin 45 mg/kg BB dan Staphylococcus

aureus 105 CFU/mL secara intraperitoneal

P2 = Tikus diinduksi streptozotosin 45 mg/kg BB dan Staphylococcus

aureus 106 CFU/mL secara intraperitoneal

P3 = Tikus diinduksi streptozotosin 45 mg/kg BB dan Staphylococcus

aureus 107 CFU/mL secara intraperitoneal

Tabel 4.2. ANOVA (Analysis of Variance)

Sumber Variasi F XXX F 5% F 1%

df X SS MSXX
(S.V.) Calc Tabel Tabel
Treatment 4 3,01 4,77
 32

Error 15
Total 19

Keterangan :

x) d.f. varietas (treatment)= t – 1 = 5 – 1 = 4

d.f. total = nt – 1= 20 – 1 = 19

d.f. error = df total – df varietas = 19 – 4 = 15

xx) MS Varietas =

MS error =

xxx) F Calculated =

4.4.2 Persiapan Hewan Coba

Dua puluh ekor tikus putih galur wistar sebagai hewan model dibagi

kedalam lima kelompok dimana masing-masing kelompok terdiri dari empat

ekor tikus putih. Penggunaan hewan coba dalam penelitian ini sudah

mendapatkan sertifikat laik etik dari Komisi Etik Penelitian Universitas

Brawijaya dengan nomor: 973-KEP-UB (Lampiran 1). Tikus diaklimatisasi

selama tujuh hari sebelum diberikan perlakuan. Selama aklimatisasi tikus diberi

pakan standar sebanyak 10% bobot badan, yaitu sekitar 10-15 gram/ekor/hari.

Pakan diberikan pada pagi hari pada pukul 07.00 dan sore hari pada pukul 16.00

dan air minum diberikan secara ad libitum (Rista dan Yuziani, 2014).

4.4.3 Induksi Streptozotosin

 33

Sebelum dilakukan injeksi streptozotosin, tikus dipuasakan terlebih

dahulu selama 12 jam. Streptozotosin dilarutkan dalam 0.01M buffer sitrat, pH 4,5

dan selalu disiapkan dalam kondisi fresh untuk penggunaan dalam waktu 10-15

menit. Injeksi Streptozotosin diberikan secara intraperitoneal dan dosis ditentukan

berdasarkan berat badan tikus pada kelompok P1, P2 dan P3. Dosis Streptozotosin

yang diberikan 45 mg/kg BB. Injeksi Streptozotosin dilakukan hanya sekali untuk

menginduksi diabetes melitus (Saputra, dkk., 2018).

4.4.4 Pengukuran Kadar Gula Darah

Pemeriksaan kadar glukosa darah menggunakan metode enzimatik,

menggunakan alat pengukur gula darah (Gluko-Dr®) bereaksi secara spesifik

dengan glukosa yang terdapat di dalam darah. Molekul glukosa yang dioksidasi oleh

enzim Glukose Oksidase (GOD) menghasilkan elektron yang ditangkap oleh

elektroda sehingga kadar glukosa berbanding lurus dengan sinyal elektronik yang

diterima. Jumlah darah yang dibutuhkan untuk mengukur kadar glukosa darah

adalah 2,5-4,0μL, darah diletakkan pada sisi kanan test strip, darah akan terserap

secara otomatis dan hasil pengukuran akan terbaca setelah sebelas detik pada

Gluko-Dr test Meter. Kadar glukosa darah diukur dalam satuan mg/dL. Tikus

dengan kadar gula darah puasa lebih dari 200 mg/dL menandakan bahwa tikus

tersebut mengalami diabetes (Saputra, dkk., 2018).

4.4.5 Pembuatan Suspensi dan Induksi Staphylococcus aureus

Koloni S. aureus yang didapat dari Fakultas Kedokteran Universitas

Brawijaya ditumbuhkan pada media NAP, kemudian 10 koloni bakteri diambil

 34

menggunakan ose kemudian disuspensikan pada 10 ml nutrient broth.

Kekeruhan bakteri dihitung menggunakan spektrofotometer dengan panjang

gelombang 625 nm dan nilai absorbansi 0,6 x 10 8 CFU/ml setara dengan

konsentrasi bakteri 108 CFU/ml. Pengenceran dilakukan dengan 1 ml suspensi

bakteri S. aureus 108 CFU/ml dimasukkan dalam 9 ml nutrient broth, kemudian

dihomogenkan menggunakan vortex, maka akan didapatkan suspensi bakteri S.

aureus 107 CFU/ml. Cara tersebut diulangi dengan mengambil S. aureus dari

pengenceran sebelumnya hingga didapatkan S. aureus 106 CFU/ml dan 105

CFU/ml. Suspensi yang diperoleh kemudian diinjeksikan pada hewan

coba sebanyak 2 ml secara intraperitoneal (Mubarak, dkk., 2016).

4.4.6 Nekropsi dan Preparasi Organ Limpa

Sebelum di nekropsi tikus di anestesi dengan injeksi ketamin 2 mg/kg BB

secara intramuskular. Tikus diletakkan di atas stiroform yang telah dilapisi

aluminium foil pada posisi dorsal (terlentang) kemudian di fiksasi dengan

menggunakan jarum pentul pada keempat ekstremitasnya. Untuk mempermudah

preparasi, permukaan abdomen tikus dibasahi dengan alkohol 70%. Tahap

preparasi dilakukan pada linea alba dengan membuka lapisan kulit dan fascia.

Rongga abdomen dibuka sampai batas bawah diafragma. Teknik euthanasi yang

digunakan adalah intra-cardiac puncture euthanasia, yaitu dengan mengambil

darah dari jantung hingga hewan mati. Organ yang diambil adalah limpa

(Puspitasari, 2008).

4.4.7 Flow cytomery

 35

Flow cytometry adalah metode pengukuran jumlah dan sifat sel

dengan cara sel dialirkan melalui suatu celah sempit satu per satu. Light

scattering adalah metode dimana sel dalam aliran akan melewati suatu celah.

Pada celah tersebut terdapat sensing area dan berkas cahaya akan difokuskan

di sensing area tersebut. Apabila sel mengenai berkas cahaya tersebut maka

berkas cahaya akan dihamburkan, dipantulkan, atau dibiaskan ke segala

arah. Beberapa detektor yang diletakkan pada sudut-sudut tertentu akan

menangkap berkas-berkas cahaya tersebut, mengubahnya menjadi sinyal

listrik, dan kemudian sinyal tersebut akan dianalisis oleh komputer.

Keuntungan dari flow cytometry ini adalah tingkat efisiensi dan sensitivitasnya

yang tinggi (Nathalia, 2014).

4.4.8 Analisis Data

Data infeksi S. aureus didapatkan data kualitatif dari gejala klinis yang

muncul seperti berat badan, temperatur, pulsus, dan keberadaan bakteri pada

organ. Data diabetes didapatkan berupa data kuantitatif yaitu kadar gula darah.

Kadar relatif SOD dan NF-KB berupa data kuantitatif yang dianalisis dengan

menggunakan Uji One Way Analysis of Variance (ANOVA) dengan taraf

kepercayaan 95% untuk mengetahui pengaruh perlakuan terhadap pembuatan

hewan model diabetes dengan infeksi S. aureus yang dianalisis secara signifikan

dengan menggunakan program SPSS versi 17.0 untuk Windows.