Inokulasi Eksperimental pada Tikus

dan Mencit dengan Marseillevirus

Raksasa yang Mengarah ke Deteksi
Jangka Panjang Virus
Kelompok A1

Adithya Fauzan 1909511001

Kezia Joana Limarta 1909511006
Dyah Risma Aprilia Enji 1909511012
Jethro Xavier 1909511015
 Pendahuluan
● Virus raksasa amuba ditemukan pada tahun 2003, dengan isolasi
Acanthamoeba polyphaga Mimivirus dengan kultur bersama pada
amuba. Marseilleviridae adalah keluarga baru virus raksasa amuba yang
didefinisikan pada tahun 2012.

● Kehadiran virus raksasa amuba, termasuk virus marseille dalam materi

biologis manusia, baru-baru ini diungkapkan oleh metagenomik
throughput tinggi, yang mengonfirmasi kontak antara virus ini dan
manusia.
 Tujuan

Membuat model murine menggunakan tikus dan mencit dan rute inokulasi
yang berbeda untuk menilai penyebaran dan persistensi Marseillevirus pada
organisme mamalia. Rute aerosol, kami pikir rute yang masuk akal dari
penularan virus yang ditularkan melalui air ini (Boyer et al., 2009), diuji terlebih
dahulu dengan fokus khusus pada lokalisasi dan persistensi virus di jaringan
limfoid terkait hidung (NALT) sebagai setara ke amandel manusia. Juga
menguji rute intraperitoneal dan intravena pada tikus dan tikus.
BAHAN & METODE
 Pernyataan Etika &
Prosedur Umum in Vivo
● Digunakan tikus Balb/c usia 4-8 minggu, 16-25g, dan tikus Swiss berat 330-770 g.
● Kandang plastik dengan 5 tikus atau 2 tikus per kandang, ada dalam lemari bertekanan
berventilasi
● Akses bebas untuk air dan makanan diet standar sampai waktu percobaan
● Inokulasi jalan pernapasan dilakukan dengan pemberian aerosol menggunakan sistem
paparan inhalasi seluruh tubuh A4224.
● Inokulasi intraperitoneal (IP) dan intravena (IV) dilakukan di bawah anestesi volatil dengan
isofluran 5%, dengan tusukan perut perkutan untuk IP atau injeksi ke vena ekor untuk IV.
● Hewan kontrol menerima phosphate buffered saline (PBS) melalui rute aerosol, IP atau IV.
● Sampel darah diambil dari tikus yang disuntik IV dari waktu ke waktu dengan tusukan vena
ekor untuk menggambarkan kinetika viremia.
● Tikus Swiss dieutanasia dengan thiopental yang diberikan secara intraperitoneal dan tikus
Balb/c dieutanasia dengan exsanguination yang dilakukan di bawah anestesi volatil.
● Sampel darah dan organ tambahan dikumpulkan post-mortem.
 Strain, Kondisi Kultur, dan Persiapan
Inokulum Infektif untuk Hewan Percobaan
● Strain Marseillevirus T19 dikultur bersama pada axenic Acanthamoeba castellanii, dalam peptone
yeast extract broth dengan medium glukosa.
● Supernatan kultur kemudian dipekatkan dan dimurnikan lalu dicuci dalam PBS.
● Virus yang telah dimurnikan dialiquot dan disimpan pada suhu -80◦C untuk digunakan lebih lanjut.
● 10 hari sebelum hewan diinokulasi, virus viable diukur dengan pengenceran titik akhir dengan kultur
bersama pada A. castellanii.
● Pada tahap akhir, pengenceran serial suspensi virus dengan faktor pengenceran 10 diinokulasikan
ke amuba pada konsentrasi 5.105/mL yang disimpan dalam plat sumur 24.
● Amuba diinokulasi dengan setiap pengenceran virus dalam rangkap empat.
● Amuba diperiksa untuk lisis 7 hari setelah inokulasi.
● Konsentrasi virus viable (7- 7,5 unit log per L) adalah yang memungkinkan lisis amuba di dua sumur
dari empat yang diinokulasi dengan konsentrasi ini.
● Virus yang dimurnikan segera diencerkan dalam PBS sebelum menginokulasi hewan → untuk
mencapai inokulum yang sesuai.
 Inokulasi Marseillevirus in Vivo
● Untuk inokulasi saluran pernapasan, 81 tikus Balb/c (34 jantan, 47 betina) diinokulasi aerosol
dengan suspensi PBS yang mengandung 9 log unit virus per mL yang ditempatkan ke dalam
botol kaca untuk pembuatan aerosol venturi cair.
● Sebagaimana dinilai pada hewan yang dieutanasia sesaat setelah paparan aerosol,
inokulum paru virus awal berkisar antara 4,9 dan 5,7 (rata-rata 5,6) unit log salinan virus per
juta sel murine. Untuk inokulasi parenteral, 8 log unit virus viable yang diencerkan dalam 300
L PBS disuntikkan ke 21 tikus Swiss secara IV dan 12 lainnya secara IP. Untuk tikus Balb/c, 7
unit log virus yang viable diencerkan dalam 200 L PBS disuntikkan IP.
Tindak Lanjut dan Pengambilan Sampel
● Setelah inokulasi, hewan diamati setiap hari untuk tanda-tanda ketidaknyamanan atau penyakit.
● Rute IP dievaluasi selama 24 jam pada tikus Balb/c sampai 2 minggu pasca-inokulasi (PI) dalam
serangkaian tikus Swiss yang di-eutanasia pada 12 jam, dan pada hari 1, 3, 7, 14, dan 43 PI.
● Rute IV pada tikus Swiss dievaluasi sampai hari ke 43 PI, dengan evaluasi berlangsung pada 12 jam,
dan pada hari 1, 2 (hanya darah), 3, 7, 14, 21, 30, dan 43 PI.
● Rute aerosol pada tikus Balb/c dinilai sampai 1 bulan PI dengan evaluasi berlangsung pada 2 jam, dan
pada hari 1, 7, 14, 21, dan 30 PI.
● Limpa, hati, dan darah semua hewan dikumpulkan.
● Sampel kelenjar getah bening omentum dan mesenterika dari tikus Swiss yang diinokulasi IP, kelenjar
getah bening serviks dari tikus Swiss yang diinokulasi IV, paru-paru, jaringan limfoid nasal (NALT), dan
kelenjar getah bening serviks dan trakea dari tikus Balb/c yang diinokulasi aerosol diambil segera
setelah kematian. Berat limpa segera dicatat dan darah dialiquot untuk PCR dan serologi.
● Organ perut yang diambil didekontaminasi dalam dua rendaman etanol dan kemudian dicuci dalam
PBS sebelum kultur dan pemrosesan PCR.
● Setiap organ yang baru diambil sampelnya dihancurkan secara terpisah dalam PBS untuk kultur
bersama amuba dan ekstraksi DNA dilakukan untuk PCR.
● Sampel representatif dari paru-paru, kelenjar getah bening, NALT, limpa, dan hati dari setiap evaluasi
difiksasi dalam formalin 4% untuk analisis histologis.
 Ko-Kultur Amoeba
A.castellanii dikultur pada 28◦C di PYG. Ketika amoeba menyatu, mereka disentrifugasi, dan pelet
disuspensikan kembali dalam Page’s amoeba saline solution steril dua kali. Akhirnya, amuba disuspensikan
kembali dalam larutan survival buffer pada konsentrasi akhir antara 5,105 dan 1,106 sel/mL dengan
campuran antimikroba yang terdiri dari imipenem / cilastatin (10 μ g/mL), vankomisin (10 μ g/mL),
ciprofloxacin (20 μ g/mL), doksisiklin (20 μ g/mL), dan vorikonazol (20 μ g/mL). Amoeba didistribusikan dalam
24-well plates (500 μ L kultur amuba per sumur). 50 μ L masing-masing organ yang dihancurkan kemudian
diendapkan pada lapisan sel dan diinkubasi pada suhu 30◦C selama 3 hari. Dua sub-kultur dilakukan. Ketika
lisis amuba terjadi, 100 μ L konten sumur terlihat pada slide dan diwarnai menggunakan pewarnaan
hemacolor (Hemacolor ®, Merck, Darmstadt, Jerman) untuk memeriksa keberadaan pusat produksi virus .
Sumur yang hanya berisi amuba dimasukkan ke dalam setiap lempeng mikro sebagai kontrol negatif.
Deteksi Molekular dari Marseillevirus
● DNA dari total darah dan dari organ yang dihancurkan diekstraksi menggunakan QIAamp Tissue Kit
(Qiagen).
● Dua sistem primer dan probe spesifik digunakan untuk PCR kuantitatif real-time. Kedua sistem ini
menargetkan secara khusus MAR_ORF210 dan MAR_ORF055
● Ketika amplifikasi diperoleh dan sinyal fluoresensi dihasilkan dengan menguji kedua sistem PCR,
hasilnya dianggap positif jika ambang siklus <35 untuk setidaknya satu dari dua sistem. Ketika
amplifikasi diperoleh dan sinyal fluoresen dihasilkan dengan hanya satu dari dua sistem, yang mana
pun ambang siklusnya, hasilnya dianggap negatif.
● Tes PCR waktu nyata dilakukan menggunakan Sistem Deteksi qPCR CFX96® (Bio-Rad, Prancis). Kontrol
negatif terdiri dari DNA yang diekstraksi dari organ dan darah tikus dan tikus yang ditantang PBS (dua
hewan untuk setiap rute inokulasi). Kontrol positif adalah DNA yang diekstraksi dari supernatan kultur
Marseillevirus.
Deteksi Antibodi pada Sera menggunakan Immunofluorescence Assay
Marseillevirus yang dimurnikan terlihat pada slide mikroskop. Sera yang dikumpulkan dari tikus dan mencit
diuji pada pengenceran 1:50 dalam PBS. Sera diendapkan di tempat dan diinkubasi 30 menit pada 37◦C.
Slide dicuci dua kali dalam PBS/Tween20 0,5% selama 8 menit, sekali dalam air suling selama 8 menit,
kemudian dikeringkan. Adanya antibodi dideteksi menggunakan IgG anti-tikus kambing terkonjugasi FITC
(fluorescein isothiocyanate) (Immunotech, Marseille, Prancis), IgM anti-tikus pada pengenceran 1:400
(Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, USA) untuk serum tikus, dan IgG anti-tikus (Jackson
ImmunoResearch, Suffolk, United Kingdom) untuk serum tikus, dengan counterstain biru Evans 0,25%. Slide
diinkubasi pada suhu 37◦ C selama 30 menit, dicuci dua kali dalam PBS/Tween 20 0,5% selama 8 menit,
sekali dalam air suling selama 8 menit, kemudian dikeringkan. Slide kemudian diamati setelah menambahkan
1 tetes Fluoprep (Biomérieux, Prancis) dan kaca penutup, pada mikroskop Leica DM 2.500 (Leica, Wetzlar,
Jerman) pada panjang gelombang 488nm. Sebagai kontrol negatif, serum dari mencit yang tidak diimunisasi
dimasukkan dalam setiap percobaan. Kontrol positif berupa serum dari kelinci yang diimunisasi.
HASIL
 HASIL

Diseminasi Virus Ketahanan Virus

● IP : darah, limpa, hati ● IP : 14 hr pascainokulasi
● IV : darah, limpa, hati, ● IV : 14-21 hr pascainokulasi
paru-paru ● Aerosol : 21 hr pascainokulasi
● Aerosol : NALT, paru-paru (paru-paru), 30 hr (NALT)

Temuan Klinis &

Serologi Histopatologi
● IgG: IP, IV, aerosol
● IgM: negatif Negatif
PEMBAHASAN
 PEMBAHASAN
● Merupakan penelitian pertama yang memberi marseillevirus dengan sengaja
ke hospes murine
● Penelitian ini dikaitkan dengan keberadaan virus raksasa lainnya yang
pernah dideteksi pada manusia (mimivirus, Acanthocystis turfacea Chlorella
Virus I)
● Model IP menunjukkan keberadaan virus di darah pada awal pemberian dan
di limpa selama 2 minggu
● Model IV menunjukkan ketahanan virus di limpa selama 3 minggu
● Model aerosol menunjukkan ketahanan virus di NALT selama 30 hari
● Mirip dengan ketahanan marseillevirus pada sampel faring manusia
● Belum ada penelitian yang menyatakan marseillevirus bereplikasi dan
mengakibatkan penyakit di sel mamalia
TERIMA KASIH