DIAGNOSTIK MOLEKULER II

TUGAS ISOLASI DNA Human papillomavirus (HPV) DARI SAMPEL SERVIKS

Disusun untuk Memenuhi Tugas Mata Kuliah Diagnostik Molekuler II

Dosen Pembimbing:

Dewi Inderiati, S.Si., M.Biomed

Drs. Chairlan, M.Biomed
Maroloan Aruan, M.Si

Disusun oleh:

Widya Puji Listiyani P3.73.34.2.16.038

D-IV TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIK

POLTEKKES KEMENKES JAKARTA III
2019
 Isolasi DNA Human papillomavirus (HPV) dari Sampel Serviks

TUJUAN PRAKTIKUM
 Untuk mengetahui prinsip kerja isolasi DNA Human papillomavirus (HPV) dari
sampel serviks
 Untuk mengetahui cara kerja isolasi DNA Human papillomavirus (HPV) dari sampel
serviks
 Untuk mengetahui prinsip kerja elektroforesis DNA Human papillomavirus (HPV)
dari sampel serviks
 Untuk mengetahui cara kerja elektroforesis DNA Human papillomavirus (HPV) dari
sampel serviks

DASAR TEORI
Human papillomavirus atau HPV adalah virus yang dapat menyebabkan
tumbuhnya kutil di berbagai bagian tubuh. Virus ini hidup pada sel-sel kulit dan
memiliki lebih dari 100 jenis. Ada sekitar 60 jenis HPV penyebab kutil yang biasanya
menginfeksi bagian-bagian tubuh seperti kaki dan tangan, sementara 40 lainnnya
memicu munculnya kutil kelamin. Tidak semua HPV dapat menyebabkan kanker.
Namun ada beberapa jenis HPV yang berbahaya, seperti HPV 16 dan HPV 18,
berpotensi besar memicu terjadinya kanker serviks. WHO (World Health
Organisation) memperkirakan sekitar 70% kanker serviks disebabkan oleh kedua
jenis HPV tersebut.
Sebagian besar penularan HPV terjadi akibat adanya sentuhan langsung kulit
ke kulit dengan pengidap. Demikian pula dengan benda yang terkontaminasi virus
HPV. Hubungan seksual juga termasuk salah satu sarana penularan virus ini pada
kelamin. Misalnya melalui kontak langsung dengan kulit kelamin, membran
mukosa, pertukaran cairan tubuh, serta seks oral atau anal.
Di dalam sel terdapat asam nukleat, yaitu DNA dan RNA. DNA merupakan
materi genetic yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses
metabolisme dalam setiap organisme. Molekul DNA terdapat di luar inti sel ini terikat
membentuk kromosom. Dapat ditemukan di nucleus, mitokondria, kloroplas, dan
plasmid (bakteri). DNA yang menyusun kromosom ini merupakan nukleotida rangkap
yang tersusun rantai ganda (double helix) DNA akan terurai menjadi untai tunggal
(single helix).
Isolasi DNA adalah suatu teknik yang digunakan untuk memperoleh DNA
murni, yaitu bebas dari protein dan RNA dari suatu sel dalam jaringan. Pada proses
isolasi DNA ini, sel eukariotik harus dihancurkan terlebi dahulu melalui cara mekanik
dan enzimatik. Hal ini disebabkan membrane sel dari membrane inti sebagian besar
tersusun atas lipid.
Prinsip kerja isolasi DNA yang harus diperhatikandan dilakukan dengan benar
yaitu, (1) Pemecahan dinding sel atau jaringan yang DNA-nya akan di isolasi.
Pemechan dinding sel yang sering dilakukan adalah dengan menggunkan bahan
kimia. Sel dirusak dengan buffer lysis yang mengandung senyawa kimia yang dapat
merusak interitas barrier dinding sel. Senyawa kimia yang umumnya digunakan
adalah lysosim, EDTA (Ethylen Diamine Tetra Asetat), Tris-Cl, atau detergen SDS
(Sodium Deodecyle Sulphate). (2) Pemisahan DNA dari debris sel yaitu RNA dan
protein agar diperoleh DNA yang murni, dengan membuang atau memisahkan
pengotor DNA dengan etanol dinngin. Pemurnian DNA dari debris sel juga dapat
dilakukan dengan menggunakan bahan kimia (fenol, kloroform, isopropanol, isoamyl
alcohol). Pemurnian DNA dari kontaminan protein dapat dilakukan dengan
menggunakan enzim protease yaitu Pronase atau proteinase K, dan kontaminan RNA
dengan menggunakan RNAse. (3) Presipitasi akhir DNA dapat dilakukan dengan
menggunakan etanol dingin dibawah kondisi ionic yang kuat. Dan di cuci dengan
EtOH 70%. Pellete DNA dilarutkan dengan buffer TE atau ddH2O steril.
Setelah melakukan proses isolasi DNA, kemudian melakukan proses
elektroforesis. Elektroforesis adalah teknik yang digunakan untuk memisahkan dan
memurnikan suatu makromolekul asam nukleat berdasarkan perbedaan ukuran dengan
prinsip kerja muatan listrik.
Prinsip kerja elektroforesis adalah berdasarkan pergerkan partikel-partikel
bermuatan negative (anion) dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub
positif (anode), sedangkan partikel-partikel bermuatan positif (kation) akan bergerak
menuju kutub negatif (anode). Elektroforesis digunakan untuk mengamati hasil
amplifikasi dari DNA. Hasil elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya band
yang merupakan fragmen DNA hasil amplifikasi dan menunjukkan potongan-
potongan jumlah pasangan basanya.
ALAT DAN BAHAN
A. Alat dan Bahan Isolasi DNA Human papillomavirus (HPV)
Alat :
- Micropipet 10, 100, dan 1000 µl
- Rak tabung
- Centrifuge
- Vortex
- Inkubator 56oC
- Waterbath

Bahan :
- Sampel swab HPV
- 1.5 ml Microtube
- Microtips kuning dan biru
- Phospat buffer saline (PBS)
- Buffer AL
- Protease
- QIAamp Mini spin column
- Collection tube 2 ml
- Etanol dingin 96-100%
- Buffer AW1
- Buffer AW2
- Buffer AE

B. Alat dan Bahan Elektroforesis DNA Human papillomavirus (HPV)

Alat:
- Satu set alat elektroforesis
- Micropipet
- Power supply
- Gel Doc
- Oven
- Erlemenyer
- Timbangan (Neraca analitik)
 Bahan:
- Produk DNA (hasil isolasi)
- Kertas timbang
- DNA Marker atau DNA Ladder
- Ethidium Bromide (EtBr) atau Gel Red
- Microtips
- Dd H2O
- Gel agarose
- Loading dye (Loading buffer)
- Buffer TEA
- Buffer TBE 1x
- Aquades
- Tempat limbah

CARA KERJA

A. Isolasi DNA Human papillomavirus (HPV)

1. Pastikan menggunakan APD yang lengkap agar terhidar dari bahan infeksius dan
kontaminasi lainnya;
2. Siapkan alat dan bahan yang diperlukan;
3. Masukkan 1250 µl sampel swab HPV ke dalam microtube. Sentrifugasi dengan
kecepatan 5000 rpm selama 10 menit. Buang supernatan dan hanya tersisa pellete di
microtube;
4. Lakukan proses pencucian : Tambahkan PBS sebanyak 1000 µl ke dalam sampel.
Vortex selama 15 detik. Sentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 1 menit.
Buang supernatan dan tersisa pellete di microtube;
5. Lakukan proses pencucian kedua: Tambahkan PBS sebanyak 1000 µl ke dalam
sampel. Vortex selama 15 detik. Sentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 1
menit. Buang supernatan secara perlahan sampai tersisa volume akhir 200 µl
supernatan di microtube;
6. Tambahkan sebanyak 20 µl protease dan 200 µl buffer AL. Vortex selama 15 detik.
Inkubasi pada suhu 56 oC selama 10 menit;
7. Tambahkan 230 µl etanol dingin. Vortex selama 15 detik;
 8. Pindahkan campuran di microtube ke dalam QIAamp mini spin column dengan hati-
hati agar ujung microtips tidak merobek saringan di dalam mini spin column.
Sentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit;
9. Buang filtrat (larutan yang ada di collection tube). Masukkan buffer AW 1 sebanyak
500 µl ke dalam QIAamp mini spin column. Sentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm
selama 1 menit;
10. Buang filtrat (larutan yang ada di collection tube). Masukkan buffer AW2 sebanyak
500 µl ke dalam QIAamp mini spin column. Sentrifugasi dengan kecepatan maksimal
di centrifuge (15000 rpm) selama 3 menit;
11. Buang filtrat (larutan yang ada di collection tube). Ganti collection tube dengan yang
baru;
12. Masukkan buffer AE sebanyak 50 µl ke dalam QIAamp mini spin column. Inkubasi
pada suhu ruang selama 1 menit. Sentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 1
menit;
13. Masukkan buffer AE yang kedua kalinya sebanyak 50 µl ke dalam QIAamp mini spin
column. Inkubasi pada suhu ruang selama 1 menit. Sentrifugasi dengan kecepatan
8000 rpm selama 1 menit;
14. Pindahkan campuran yang ada pada collection tube ke dalam microtube 1.5 ml;
15. Simpan sampel di refrigerator bila tidak segera dilakukan proses pengujian;
16. Rapikan alat dan bahan yang telah digunakan ke tempat semula;
17. Bersihkan meja kerja dengan lysol.

B. Elektroforesis DNA Human papillomavirus (HPV)

1. Membuat gel agarose 1%
 Buat perhitungan untuk gel agarose 1%. Timbang gel agarose sebanyak 1 gr,
kemudian larutkan ke dalam 100 mlbuffer TEA. Homogenkan
 Tambahkan gel red sebanyak 1 µl
 Panaskan di dalam oven sampai gel agarose larut dan homogen
 Setelah gel agarose jadi, diamkan sampai suhu menurun (agar tidak terlalu panas)
 Kemudian masukkan gel agarose ke dalam cetakan elektroforesis yang sudah di
letakkan sisir untuk membuat sumur
 Tunggu sampai gel agarose mengeras baru bisa digunakan untuk elektroforesis
2. Gel agarose 1% yang telah dibuat, di tempatkan ke dalam penampung elektroforesis
 3. Tambahkan penampung dengan buffer TBE 1x hingga gel agarose terendam (TBE
sebagai elektrolit)
4. Pipet mix sampel DNA hasil isolasi sebanyak 3 µl + 1 µl loading dye. Masukkan
campuran tersebut ke dalam satu sumur atau well
5. Masukkan DNA ladder sebanyak 3 µl ke sumur yang lainnya
6. Tutup elektroforesis, sambungkan electrode + (warna merah) dan electrode – (warna
hitam) sesuai dengan posisinya di elektroforesis. Nyalakan elektroforesis, dan siap di
running
7. Running elektroforesis dengan tegangan 120 volt kira-kira selama 45 menit, atau
sampai posisi pergerkan pita DNA di ujung batas. Jangan sampai melewati batas
karena hasil tidak bagus dan tidak dapat di lakukan pembacaan hasil. Jika hampir
sampai batas, maka proses dihentikan
8. Amati dan baca hasil pita DNA dari elektroforesis dengan menggunakan Gel Doc.
9. Laporkan hasil pengamatan

Hasil
A. Hasil Isolasi DNA Human papillomavirus (HPV)

Gbr 1. Sampel awal pengambilan Gbr 2. Hasil isolasi DNA HPV

(sumber: doc pribadi) (sumber: doc pribadi)

B. Hasil Elektroforesis DNA Human papillomavirus (HPV)

 Gbr.3 Hasil Elektroforesis DNA HPV
(sumber: doc pribadi)
Keterangan :
 B1 = Pita DNA tebal
 B2 = Pita DNA tipis
 L = DNA ladder
 B3 = Pita DNA agak tebal
 B4 = Pita DNA tipis

Pembahasan
Hasil praktikum menunjukkan hasil isolasi DNA HPV menggunakan sampel
serviks pada kelompok B4 menghasilkan pita DNA yang tipis.

Kesimpulan
Hasil isolasi DNA HPV dengan menggunakan sampel serviks belum dapat
dipastikan, sehingga harus dilakukan pemeriksaan lanjutan yaitu dengan
menggunakan PCR.

Referensi
Modul diagnostic molekuler tentang isolasi DNA
Modul diagnostic molekuler tentang elektroforesis DNA
Setiawati, D. (2014). Human Papilloma Virus Dan Kanker Serviks. Public Health
Science, 450–459.
https://biologicallytested.wordpress.com/2010/01/29/elektroforesis-pcr/