STUDI PUSTAKA PENYAKIT BAKTERIOLOGI

KOASISTENSI BAKTERIOLOGI
MYCOPLASMOSIS PADA AYAM

KELOMPOK KOAS 1A
AGATHA SADA UA
NIM. 2009020026
 Mycoplasmosis atau chronic respiratory
disease (CRD) adalah penyakit menular
ETIOLOGI menahun pada ayam yang disebabkan
oleh Mycoplasma gallisepticum

 Berukuran 0,25-0,50 mikron,

berbentuk pleomorfik, kokoid
dan tidak mempunyai dinding sel
sejati (Soeripto, 2009).
 Gram negatif
 Koloni bergaris tengah 0,20-
0,30 mm, halus, bulat, jernih,
daerah tengah menebal dan
menonjol
 Kontak
langsung
Horizontal

Kontak tidak
CARA langsung
PENULARAN

Telur yang
Vertikal dihasilkan oleh induk
penderita
 PATOGENESIS

Rongga Adhesin dan

hidung protein yang
disebut bleb

Reseptor epitel yang

disebut
sialoglycoprotein
Penetrasi dan merusak Airsacculitis
mukosa epitel sambil
memperbanyak diri
Bergerak menuju kantong
membran udara abdominal
Keluarnya cairan eksudat
bening (catarrhal) dari
rongga hidung, bersin -
bersin, batuk, ngorok dan
konjungtivitis  eksudat GEJALA KLINIS
hidung yang keluar menjadi
agak kental turunnya
napsu makan, berat badan
dan produksi telur.
 PERUBAHAN
PATOLOGI ANATOMI
Peradangan pada trakhea
dan kantong membran udara
disebut airsacculitis
airsac disease
 Pewarnaan
Kultur Bakteri
Gram

TEKNIK
DIAGNOSA Uji Biokimia

Uji Serologis
Metode Deteksi
Asam Nukleat
PENGAMBILAN SAMPEL

Sampel untuk pemeriksaan laboratorium dapat diambil dari unggas hidup, bangkai segar atau bangkai
unggas yang telah dibekukan saat segar.
Swab dapat diambil dari celah choanal, orofaring, kerongkongan, trakea, mata dan kloaka  ungags
hidup
Sampel dapat diambil dari hidung rongga, sinus infraorbital, trakea, atau kantung udara ungags mati .
Transportasi  sampel harus ditempatkan dalam media cair (broth mycoplasma) atau swab dicelup ke
dalam media sebelum dipakai atau swab direndam dalam media dipakai dan dipindahkan ke tabung lain
(OIE, 2018).
Kultur bakteri
 prinsip : untuk mendapatkan kultur murni yang selanjutnya akan diidentifikasi

 Mikoplasma cair  mycoplasma broth base (gibco), cystein HCL (BDH), phenol red (chroma), thallous
acetate (BDH) dan aquadestilata.
 Mikoplasma agar  tidak diberi phenol red, tetapi ditambah dengan 0,01% actidione (up jhon), 1% special

noble agar (difco) dan 3% agar bakto (difco) (soeripto dan andriani, 2006).
 Metode

• Swab sinus di masukkan ke dalam broth mycoplasma, inkubasikan selama 48 jam pada suhu 37 C 0

• Lalu dikultur di media padat (mycoplasma agar), dengan cara mengambil larutan broth mycoplasma dengan
menggunakan pipet tetes kemudian diteteskan sebanyak 1 tetes di atas permukaan media padat.

• Setelah diteteskan, kemudian ambil osse yang steril dan difiksasi dalam bunsen selama ± 5 detik hingga
ujung osse panas.
• Kemudian goreskan pada permukaan media padat yang telah diteteskan larutan broth mycoplasma yang
telah diberi spesimen swab sinus.

• Inkubasikan selama 48 jam dengan cara memasukkan media mycoplasma agar ke dalam toples
• Sebelum memasukkan mycoplasma agar, terlebih dahulu memasukkan tissue yang telah dibasahi dengan
aquades kedalam toples sebagai alas

• Sebelum toples ditutup lilin dinyalakan dan dimasukkan kedalam toples selanjutnya toples ditutup dan
biarkan lilin sampai mati

• Inkubasi selama 48 jam pada suhu 37 C kemudian amati dibawa mikroskop

0

Interpretasi : bentukan seperti telur mata sapi (sangat khas) memiliki inti
 Mycoplasma yang tampak
seperti telur goreng (ciri
khas ) ditemukan pada
hari ke 8.

Organisme pada
M. gallisepticum
mycoplasma agar
dibawah mikroskop
ditemukan pada hari ke 4.
PEWARNAAN GRAM
Prinsip : untuk menggolongkan jenis bakteri apakah termasuk
gram positif atau gram negatif.
Metode :
A. Buat apusan bakteri pada kaca objek kering dan bersih.
Kemudian fiksasi diatas nyala api bunsen atau di udara.
B. Warnai dengan larutan kristal violet selama 1 - 1,5 menit.
Kemudian cuci dengan air suling.
C. Tetesi dengan larutan garam iodin dan biarkan selama 1 menit.
D. Cuci dengan larutan alkohol 95 % sampai warnanya terhapus,
selama 30 detik. Kemudian cuci dengan air.
E. Warnai dengan safranin selama 2 menit. Kemudian cuci dengan Mycoplasma (40X)
air dan buang kelebihan air dengan menggunakan kertas hisap
F. Keringkan diudara atau diatas nyala api bunsen dan amati
dibawah mikroskop

Interpretasi : warna merah jambu  gram negatif dan bentuk

kokoid
METODE DETEKSI ASAM NUKLEAT

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Prinsip: untuk memperbanyak materi genetik bakteri
Primer M. gallisepticum terdiri dari urutan :
F: ‘CGC-AAT-TTG-GTC-CTA-ATCCCC-AACA’
R: ‘TAA-ACC-CAC-CTC-CAG-CTT-TAT-TTC’
KOMPONEN UTAMA PADA PROSES PCR

• DNA cetakan
• Oligonukleotida primer
• Deoksiribonukelotida trifosfat (dNTP)
• Enzim DNA polymerase  Taq DNA polimerase  bakteri Thermus aquaticus
• Senyawa buffer
CARA KERJA :
• Denaturasi  Pemisahan DNA untai ganda menjadi DNA untai tunggal (94°C
selama 5 menit dilanjutkan pada suhu 94°C selama 30 detik)

• Annealing  Penempelan primer pada pita DNA (58°C selama 30 detik)

• Ekstensi  Pemanjangan primer  enzim Taq DNA polimerase (72°C selama
30 detik selama 35 siklus

• Diakhiri dengan ekstensi akhir pada 72°C selama 7 menit.

Amplifikasi 300 bp (Lynsyansky et al., 2005)
UJI SEROLOGIS

A. Rapid Serum Agglutination (RSA) / Teknik Uji Aglutinasi Cepat

 Prinsip : deteksi antibodi
 Metode :
1. Mencampur serum yang akan diuji dengan antigen Mycoplasma gallisepticum
2. Sebanyak 20 μl antigen dan 20 μl serum ayam diletakkan pada lempeng kaca dengan posisi bersampingan
menggunakan pipet mikro.

3. Kemudian antigen dan serum dicampur menggunakan alat pengaduk.

4. Pembacaan reaksi aglutinasi dilakukan dua menit setelah pencampuran.
Interpretasi :
(+ ve) jika terjadi penggumpalan antara antigen dan serum
(- ve) jika tidak terjadi penggumpalan antara antigen dan serum
B. Uji Hambat Hemaglutinasi / Hemaglutination Inhibition Test (HI)

 Prinsip : untuk mendeteksi antibodi terhadap M. Gallisepticum

 Metode

• Tambahkan 50 µl PBS ke sumuran pertama di setiap baris.

• Tambahkan 8 unit antigen ha 50 µl ke dalam sumuran kedua di setiap baris dan tambahkan 50 µl 4 unit
antigen ha untuk masing-masing sumuran 3 sampai 8.

• Tambahkan 50 µl pengenceran 1/5 serum yang diuji sebelumnya ke sumuran pertama, kemudian campur
dan pindahkan 50 µk ke sumuran kedua dan seterusnya. Buang 50 µl dari sumuran terakhir.
• Enam sumur diperlukan untuk kontrol antigen. Tambahkan 50 µl PBS ke sumuran 2 sampai 6 dan
tambahkan 50 µl antigen unit 8 HA ke sumuran 1 dan 2. Kemudian campur sumuran 2 dan pindahkan 50
µl ke sumuran 3, campur dan ulangi hingga sumuran 6 dan buang 50 µl.
• Dua sumur diperlukan untuk kontrol rbc. Tambahkan 50 µl PBS ke masing-masing sumuran.
• Tambahkan 50 µl suspensi sel darah merah 0,5% ke semua sumuran.
• Homogenkan isi sumur dan baca setelah diinkubasi selama kurang lebih 50 menit pada suhu kamar.
 Interpretasi : titer 1/80 atau lebih dianggap positif dan titer 1/40 kuat untuk dicurigai (NPIP dari AS ).
UJI SEROLOGIS

C. Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Deteksi dan identifikasi

Prinsip patogen

Metode
 100 μl kontrol negatif ditambahkan ke dalam
sumuran A1 dan B1
 100 μl kontrol positif ditambahkan ke sumuran
C1 dan D1.
 Kemudian 100 μl sampel yang telah diencerkan
ditambahkan ke dalam sumuran.
 Tutup pelat dengan penutup dan diinkubasi pada
suhu kamar (22-27°c) selama 30 menit.
 Isi sumuran disedot dan dicuci dengan 4 kali
buffer (350 μl per sumur).
Pelat dibuat terbalik dan ditab menggunakan
kertas penyerap sampai tidak ada uap air yang
terlihat.
100 μl reagen ditambahkan ke dalam sumuran.
Tutup pelat dengan penutup dan diinkubasi pada
suhu kamar (22-27°c) selama 30 menit.
Kemudian pelat dicuci dengan 4 kali buffer (350
μl per sumur).
100 μl reagen substrat ditambahkan ke dalam
sumuran.
Tutup pelat dengan penutup dan diinkubasi pada
suhu kamar (22-27°c) selama 15 menit dan amati
perubahan warna dari tak berwarna hingga
berwarna kuning kasus positif
100 l μl stop solution ditambahkan ke sumuran
untuk menghentikan reaksi.
Pelat ditempatkan pada ELISA reader dan
lakukan pembacaan hasil dengan gelombang
absorbansi 450 nm.
Interpretasi :
 Perubahan warna  kuning
 Sampel serum dengan rasio S / P ≤ 0,5
negatif. Rasio S / P > 0,5 dianggap positif
Uji Biokimia
Medium frey's dengan komposisi sebagai berikut :
• Mycoplasma broth base 22.5 g
• Glucose 30.0 g
• Serum kuda 100.0 ml
• Cysteine hydrochloride 0.1 g
• Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) 0.1 g
• Phenol red (1 per cent) 2.5 ml
• Thallium acetate (10 per cent) 5 ml
• Yeast extract (25 per cent) 100 ml
• Penicillin G potassium 1,000,000 units
• Distilled water 1000 ml
Ph  7,8 dengan NaOH 20%
Sterilkan  penyaringan  filter 0,22 µl.
Metode uji biokimia M. Gallisepticum
- Fermentasi glukosa
Frey broth diinokulasi dengan isolat dan diinkubasi pada suhu 370C selama satu minggu.
- Hidrolisis arginin
Frey broth diinokulasi dengan isolat dan diinkubasi pada suhu 370c selama satu minggu.
- Reduksi tetrazolium

Frey broth yang mengandung 5,5 mg 2,3,5-trifeniltetrazolium klorida diinokulasi dengan diisolasi dan
diinkubasi pada suhu 370C dan diamati setiap hari selama 14 hari.
- Fermentasi Glukosa: Perubahan warna dari merah muda menjadi kuning  positif  fermentasi glukosa
- Hidrolisis Arginin: Medium tetap berwarna merah muda setelah empat hari diinkubasi negatif
- Reduksi Tetrazolium: Isolat menghasilkan endapan yang tidak larut  positif (Logesh et al., 2018).
 Vaksinasi

Manajamen
Biosekuriti kesehatan hewan

PENCEGAHAN DAN
PENGENDALIAN
PENGOBATAN

Tiamulin, tylosin, lincomycin,

oxytetracyclin dan enrofloxacin 
memiliki daya kerja menghambat
sintesis protein (Bywater, 1991;
Soeripto, 2008).