Stat Fax Elisa

Pendahuluan
ELISA  uji serologi  ada tidaknya interaksi dalam suatu zat spesifik

(enzim atau antibodi) di dalam suatu serum sampel. Zat spesifik di sini

adalah zat yang hanya dapat bereaksi dengan substrat tertentu.

Serum terdapat dalam plasma darah dan berwarna kekuningan. Di

dalam serum ini terkandung antigen dan antibodi.

Pemeriksaan ELISA ini didasarkan pada ikatan spesifik antara antigen

dan antibodi yang terdapat di serum tersebut.

Prinsip ELISA
Plate dilapisi oleh antigen penangkap. Sampel serum
dimasukkan ke dalam plate, kemudian antibodi yang ada dalam
serum berikatan dengan antigen penangkap. Antigen
pendeteksi berlabel enzim mengenali dan berikatan dengan
antibodi. Enzim bereaksi dengan substrat menghasilkan produk
yang berwarna. Hasil reaksi akan memunculkan warna yang bisa
diukur secara kuantitatif dengan alat kolorimetrik (mikroplate
reader) yang dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 450
nm dan panjang gelombang 620-630 nm sebagai referensi.
Latar Belakang
TORCH  TOxoplasma, Rubella,
Cytomegalovirus dan Herpes.
Prinsip dari pemeriksaan TORCH  deteksi adanya
zat anti (antibodi) yang spesifik terhadap agen
penyebab infeksi tersebut sebagai respon tubuh
terhadap adanya benda asing (kuman/agen penyakit).
Antibodi dapat berupa Imunoglobulin M (IgM) dan
Imunoglobulin G (IgG).
 Toxoplasma
 Toxoplasmosis  zoonosis
 Penyakit ini disebabkan oleh sporozoa yang dikenal
dengan nama Toxoplasma gondii.
 Toxoplasma gondii yaitu suatu parasit intraselluler
yang menginfeksi pada manusia dan hewan.
Metode Pemeriksaan
Metode yang digunakan adalah ELISA(Enzym Linked
Immunosorbent Assay) dengan nama TOXOLISA yang
bertujuan untuk mendeteksi antibody IgM dan IgG terhadap
Toxoplasma gondii pada serum manusia
Prinsip Kerja
 Antigen Toxoplasma murni dilapisi pada permukaan microwell.
 Jika di dalam serum pasien yang ditambahkan terdapat antibodi IgG dan IgM
yang spesifik terhadap Toxoplasma, antibodi ini akan mengikat antigen.
 Bahan lain yang tidak terikat akan tercuci.

 Setelah penambahan enzim, ikatan ini akan membentuk kompleks antigen-

antibodi.
 Enzim yang berlebih kemudian dicuci, lalu ditambahkan reagen TMB.

 Reaksi katalisis enzim ini akan berhenti pada waktu tertentu. Intensitas warna
yang terjadi sebanding dengan jumlah IgG dan IgM dalam sampel.
 Kemudian hasilnya dibaca pada ELISA reader dan dikomparasikan dengan
kalibrator dan control.
Prinsip Pemeriksaan
Antibodi monoklonal spesifik terhadap Toxoplasma dilekatkan pada well
sample

serum sampel yang mengandung toxoplasma ditambahkan sehingga

terbentuk ikatan antigen-antibodi,

ditambahkan anti-toxoplasma yang dilabel konjugat peroksidase sehingga

terbentuk ikatan komplek dan melepaskan peroksida yang bereaksi dengan
chromogen membentuk senyawa berwarna biru yang intensitasnya sebanding
dengan konsentrasi toxoplasma dalam sampel.

Reaksi dihentikan dengan penambahan asam sulfat sebagai stop solution

sehingga warna berubah menjadi kuning yang dibaca absorbannya dengan
alat ELISA Plate Reader pada λ 450 nm dan 620-700 nm.
 Langkah Kerja
Persiapan
 Alat dan Bahan : Clinipet 1000 mikron
Clinipet 50 mikron
Clinipet 100 mikron
Clinipet 25 mikron
Sampel cup
Yellow tip
Blue tip
Serum sampel
Reagen ELISA
STAT FAX READER
STAT WASH

 Petugas :
- cuci tangan (Hand Hygiene) sesuai prosedur
- memakai APD (Jas Lab, handscoon) sesuai prosedur
 Alat & Bahan
Alat Bahan
Reagen
 Microwell
 Enzym Conjugate
 Mikropipet  Positif Control
 Negatif Control
 Tip  Sampel dilluent
 TMB substrat solution A
 Inkubator  TMB substrat solution B
 Stop Solution
 Elisa reader
 Wash Buffer
 Elisa washer Sampel
 Sampel serum pasien
Bahan(Reagen) Pemeriksaan
Bahan-bahan yang digunakan antara lain:
a) Microwell strip, yang telah dilapisi antigen Toxoplasma murni.
b) Reagen konjugat enzim, sebagai katalisator. Disimpan pada
botol berwarna merah.
c) Pengencer sampel
d) Kontrol negatif, pada botol berwarna jernih
e) Kalibrator, pada botol berwarna kuning. Sebagai indeks
Toxoplasma IgM=1.0
f) Kontrol positif
g) Reagen TMB
h) Larutan penutup (stop solution), yaitu HCl 1 N pada botol
berwarna jernih
i) Sampel serum
Cara Kerja
1) Microwell diletakkan di tempatnya kemudian diberi label nomor dan
identitas.
2) Disiapkan sampel yang telah diencerkan dengan perbandingan 1:4,
kontrol negatif, kontrol positif dan kalibrator. Sebagai contoh, untuk
sampel 5µl ditambahkan 20µl pengencer, dicampur hingga
homogen.
3) Dituangkan 100µl serum encer, kalibrator, dan kontrol ke dalam
sumuran(well) yang sesuai. Untuk reagen blangko, dituang 100µl
pengencer sampel pada posisi 1A. Ketuk-ketuk tempatnya untuk
mengeluarkan udara dari cairan, dan campur dengan baik. Inkubasi
pada suhu 37°C selama 30 menit.
4) Pada akhir inkubasi, pindahkan cairan dari sumuran(well). Lubang
mikrotiter dicuci dan dijernihkan 5 kali dengan buffer pencuci(1 X).
5) Dituang 100 konjugat enzim pada tiap sumuran(well) dan inkubasi
pada suhu 37°C selama 30 menit.
Lanjutan ...
6) Konjugat enzim dipindahkan dari sumuran (well). Cuci dan
jentikkan mikrotiter well 5X dengan buffer pencuci (1 X).
7) Dituang 100µl reagen TMB ke dalam tiap sumuran(well),
dicampur selama 10 detik.
8) Plate ditutup dengan penutup berwarna hitam dan inkubasi
37°C selama 5 menit.
9) Ditambahkan 100µl larutan penutup(HCl 1N) untuk
menghentikan reaksi.
10) Dicampur dengan pelan selama 30 detik. Hal ini penting agar
terjadi perubahan warna yang sempurna dari biru menjadi
kuning.Usahakan tidak terdapat gelembung udara pada tiap
sumuran(well) sebelum pembacaan.
11) Dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 450 nm dalam
waktu 15 menit menggunakan mikrowell reader/ELISA reader
 Prosedure
Penggunaan Stat Wash Elisa :

1. Pastikan isi botol larutan pencuci sesuai dengan jenis

pemeriksaan yang akan dilakukan.
2. Pastikan botol limbah/botol wash kosong
3. Tekan ON untuk menghidupkan alat
4. Tunggu sampai lampu berwarna kuning pada pump
5. Letakkan probe pada well yang akan dicuci
6. Tekan A (aspirate) untuk menghisap cairan
7. Tekan D (dispense) untuk mengeluarkan larutan pencuci
8. Cuci well sesuai prosedure pemeriksaan masing-masing
9. Tekan OFF untuk mematikan
10. Letakkan probe pada tempat yang datar dan kering
11. Bersihkan alat dan meja sekitar alat menggunakan lap
kering
 Prosedur
Penggunaan Stat Fax Reader :
1. Hubungkan kabel alat pada sumber listrik
2. Tekan ON untuk menghidupkan alat
3. Tunggu alat WARMING UP hingga muncul ready
4. Masukkan well pada rak well yang tersedia
5. Masukkan ke menu dalam layar alat, masukkan kode
pemeriksaan tekan ENTER
6. Tekan tombol 9 kemudian tekan jumlah well yang akan
dibaca dan tekan ENTER, tekan ENTER lagi untuk memulai
pembacaan
7. Hasil akan keluar secara otomatis melalui print out
8. Catat hasil pemeriksaanpada buku kerja
9. Tekan CLEAR 2x untuk kembali ke menu
10. Matikkan alat dengan menekan tombol OFF jika sudah tidak
digunakan lagi
11. Bersihkan alat dan meja sekitar alat menggunakan lap kering
 Prosedure 1 Masing microwell diisi CN, CP, serum @ 50 µl

Pemeriksaan
Serum 2
 di suhu ruangkan
Reagen 3 suhu 30°C selama 1,5 jam
Untuk 1x pemeriksaan menggunakan 3
microwell : 1 CN, 1 CP, 1 sampel 5-6x dg aquabides 20 ml + 1 ml
4
Ket : wash buffer
CP : Control Positif
CN : Control Negatif 5

6 Di ruang gelap
10 Hasil akan keluar secara otomatis
melalui print out
7
9 Tekan tombol 9  tekan jumlah well
yang akan dibaca  ENTER, tekan Tentukan jenis pemeriksaan  Tekan tombol 1 pada
8
ENTER lagi untuk memulai pembacaan alat stat fax ELISA reader untuk pemeriksaan TORCH
Perhitungan :
 Rerata absorban control negatif (NC x) harus ≤ 0,1
 Rerata absorban control positif (PC x) harus ≥ 0,6
 Nilai P – N = PC x – NC x , harus ≥ 0,5
 Nilai Cut off = NC x + 0,025
Interpretasi hasil :
 Nilai absorban spesimen pasien < cut off = non-reaktif
 x Negatif
 Nilai absorban spesimen pasien ≥ cut off = reaktif  x
Positif
 Hal-hal Yang yang perlu diperhatikan pada Pemeriksaan

 Serum atau plasma ikterik, hemolisis, atau lipemik dapat

mempengaruhi hasil pemeriksaan.

 Pencucian yang dilakukan harus sesuai dengan petunjuk

apabila ada pencucian yang tidak sempurna maka akan
mempengaruhi hasil dapat berupa positf palsu ataupun
negatif palsu.

 reaksi harus berlangsung dalam keadaan optimal di mana

kadar reaktan, temperatur, dan masa inkubasinya selalu
dijaga agar tetap berada dalam keadaan normal
 Pada beberapa macam teknik ELISA, dapat terjadi
kesalahan pengujian akibat kontrol negatif yang
menunjukkan respons positif yang disebabkan
inefektivitas dari larutan blocking sehingga antibodi
sekunder atau antigen asing dapat berinteraksi dengan
antibodi bertaut enzim signal dan menimbulkan signal.
 Reaksi antara enzim signal dan substrat berlangsung relatif
cepat, sehingga pembacaan harus dilakukan dengan cepat.
Hasil
 Negatif : Nilai indeks Toxo ≤ 0.90 atau <32 IU/ml,
mengindikasikan tidak adanya infeksi Toxoplasma.
 Meragukan : Nilai indeks Toxo 0.91-0.99 atau 32
IU/ml, sampel harus dites ulang.
 Positif : Nilai indeks Toxo ≥ 1,0 atau >32 IU/ml.Hal ini
mengindikasikan bahwa ada infeksi terhadap
Toxoplasma.
Pembahasan
 Jika IgG terhadap Toxoplasma negative, berarti pasien tidak pernah
terinfeksi. Sedangkan bila hasilnya positif, berarti pada masa lampau
pasien pernah terinfeksi Toxoplasma gondii.
 Jika IgG positif, untuk menentukan waktu terjadinya infeksi, maka
perlu dilakukan pemeriksaan lanjutan terhadap IgM Toxoplasma.
Fungsinya adalah untuk memeriksa apakah saat ini pasien terinfeksi
Toxoplasma.
 Jika IgG positif dan IgM negatif.
Pasien telah terinfeksi lebih dari setahun yang lalu. Sekarang mungkin
di dalam tubuh pasien telah terbentuk kekebalan tubuh terhadap
parasit tersebut.
 Jika IgG dan IgM positif.
Pasien tengah mengalami infeksi dalam 2 tahun
terakhir(kemungkinan terdapat pula false pada hasil IgM). Kemudian
si pasien melakukan pemeriksaan ulang IgG dan IgM setelah 2 minggu
dari pemeriksaan pertama. Bila IgM tetap positif atau ada kenaikan
titer, berarti pasien sedang terinfeksi Toxoplasma gondii.
Kesimpulan
 Tujuan pemeriksaan ELISA untuk TORCH adalah
membantu menegakkan diagnosis Toxoplasma,
Rubella, Cytomegalovirus dan Herpes.
 Prinsip pemeriksaan TORCH adalah deteksi antibody
IgG dan IgM terhadap infeksi penyakit Toxoplasma,
Rubella, Cytomegalovirus dan Herpes.
 Interpretasi hasilnya adalah jika IgG positif
menunjukkan adanya infeksi primer, sedangkan jika
IgM positif menunjukkan adanya infeksi sekunder.
 Pertanyaan & Jawaban

 Apakah penempatan urutan untuk control (-)/(+) dan sampel pada rak well memang
seperti itu (①control negatif,②control positi ,③sampel)?
jawaban :
Iya harus seperti itu, kontrol harus di depan, kontrol negatif didepan, kedua kontrol
positif dan di rak well seterusnya baru diisi sampel.
 Bisakan pada pemeriksaan dengan ELISA ini menggunakan banyak sampel ?
jawaban :
Bisa untuk banyak sampel, hanya untuk control negatif dan control positif cukup satu
saja.
 Pertanyaan & Jawaban

 Adakah alat yang spesifikasinya diatas alat yang digunakan ini (stat fax ELISA
di RS Citarum) ?
jawaban :
iya ada, untuk ELISA yang digunakan ini merupakan generasi pertama.
Untuk yang generasi kedua washernya sudah otomatis tinggal meletakkan
microwellnya alatkan berjalan otomatis mencuci kemudian petugas tinggal
mengisi wash solutionnya alat akan mencuci 6x sesuai program.
Untuk generasi ketiga, sudah otomatis ketika microwell masuk  inkubasi
berjalan otomatis sehingga dapat ditinggal untuk melakukan pekerjaan
lainnya, tetapi waktunya tetap sama 2-3 jam, inkubasinya sama tetapi otomatis
didalamnya mencampur sendiri tinggal hanya dengan tinggal memasukkan
wellnya saja.
untuk yang generasi terakhir, sudah terintegrasi antara hematologi, kimia dan
imunologi jadi satu sampel bisa.
 Pertanyaan & Jawaban

 Untuk penempatan wellnya apakah secara vertikal

atau horisontal untuk control positif, control negatif
dan sampelnya ? 1 Control negatif

jawaban : 2 Control positif

vertikal seperti ini 3 sampel

Deret I

Deret II

Deret III
 Pertanyaan & Jawaban
 Pada pemeriksaan menggunakan ELISA dapat menggunakan banyak sampel,
apakah itu untuk satu jenis parameter pemeriksaan saja atau bisa dengan
pemeriksaan lain ?
jawaban :
Tetap hanya satu jenis pemeriksaan saja, secanggih apapun alat ELISA tetap satu-
satu untuk parameter pemeriksaannya
 Untuk sampel apakah hanya menggunakan serum saja atau bisa menggunakan
plasma ?
jawaban :
Hanya serum, tidak boleh lisis, ikterik, tidak boleh ada bekuan. Untuk beberapa
parameter bisa diterima untuk infeksi seperti Hepatitis A,B,C tidak terpengaruhi
karena yang menempel pada wellnya adalah antigennya
 Kenapa inkubasinya harus diruang gelap ?
jawaban :
karena reaksi untuk reagen yang TMB itu harus diruang gelap, jika di tempat
terang TMB tidak maksimal. Reaksi akan optimal jika di ruang gelap dari pada
ruang terbuka dengan pencahayaan. Berpengaruh terhadap hasil akan berbeda,
jika yang di ruang gelap hasilnya positif tinggi tetapi jika di ruang terbuka
hasilnya positif lemah
tambahan : tidak boleh menggunakan setengah resep, karena reaksinya tidak
akan optimal yang harusnya positif bisa negatif apalagi yang baru terinfeksi
beberapa hari