BAB II

VIROLOGI

I. PEMERIKSAAN NEGRI BODIES PADA VIRUS RABIES DENGAN

PEWARNAAN SELLER

Pertemuan ke : 1 (satu)

Hari/ Tanggal : Jumat, 15 Maret 2019

Dasar Teori :

Negri bodies bersifat eosinophilic, dengan garis- garis pembatas yang tajam,
badan inklusi patognomonik (2-10 m dengan diameter) ditemukan dalam sitoplasma
sel- sel saraf tertentu yang mengandung virus rabies, terutama di dalam
hippocampus. Negeri bodies juga sering ditemukan di korteks sebelar pada sempel
otak postmortem dari korban rabies. Negeri bodies terdiri dari protein ribonuclear
yang diproduksi oleh virus diberi nama Adelchi Negri.

Adanya badan inklusi sering penting dalam diagnosis dan adanya sebuah
inclusion bodies dalam sitplasma sel- sel saraf, yaitu negri bodies, adalah patogen
untuk rabies.

Alat yang digunakan :

1. Mikroskop
2. Gelas objek
3. Pinset
4. Gunting atau cutter

Bahan yang digunakan:

1. Sampel otak
2. Pewarnaan Seller

Cara Kerja:
 1. Siapkan gelas objek
2. Potong otak yang akan diperiksa
3. Letakkan di atas gelas objek
4. Letakkan gelas objek di atas potongan otak tersebur
5. Geser berlawanan arah dengan sedikit menekan otak tersebut. Sehinggga
terbentuk lapisan otak yang agak tebal.
6. Keringkan di udara dengan di angin- angin
7. Warnai dengan pewarnaan seller, caranya adalah sebagai berikut:
a. Fiksasi preparat dengan methanol selama 15 menit
b. Warnai dengan larutan seller kira- kira 5- 10 detik
c. Sediaan dicuci dengan air kran yang mengalir dan dikeringkan
d. Sediaan selanjutnya dilihat di bawah mikroskop
e. Hasil pewarnaaan diamati
Hasil pewarnaan:
Sel- sel berwarna : biru
Negri bodies dan inti sel : berwarna merah

Hasil Pengamatan:

Gambar yang ditunjuk dengan tanda panah adalah negri bodies

Diskusi:
Virus rabies secara histology tidak ada perubahan secara spesifik seperti yang
terjadi pada jaringan selain pada otak. Terkecuali jika diikuti komplikasi dengan
penyakit lain secara umum akan terlihat normal tahapan ada perubahan spesiifik.
Perubahan yang paling signifikan atau patogenetik adalah adanya negri bodies
yaitu badan inklusi yang terdapat pada sitoplasma sel hewan yang diinfeksi oleh
rabies.

II. PEMERIKSAAN VIRUS INFLUENZA (ISOLASI VIRUS)

Pertemuan ke : 2 (dua)

Hari/ Tanggal : Jumat, 15 Maret 2019

Dasar Teori :

Virus influenza dapat menyebabkan penyakit pada manusia dan hewan.

Berbagai jenis virus influenza antara lain virus influenza type A dengan subtype yang
mengandung aglutini H terdiri dari H1- H6 dan neuramidase yang terdiri dari N1-
N7, juga virus influenza type B. Virus influenza menyerang manusia dan hewan
tergantung subtypenya dengan menimbulkan gejala bersin- bersin, ngorok, sesak
napas/ mengap- mengap.

Untuk mendapatkan virus influenza dari pasien yang terkena penyakit adalah
dengan cara mengisolasinya dari organ- organ yang terinfeksi seperti trachea, yaitu
dari swab cairan yang terdapat di trachea.

Untuk menghindari kontaminasi bakteri sebaiknya organ- organ yang

terinfeksi diambil secara aseptic dan dimasukan ke dalam larutan buffer phosphat
saline (media transport) yang mengandung antibody PSK (penicillin, streptomycin
dan kanamycin) dan sampel dibawa ke laboratorium dalam keadaan dingin dengan
suhu antara 2-8 derajat celcius.

Pada hewan (ayam) yang terinfeksi sampel dapat diambil dari organ antara lain
organ saluran pernapasan (Trachea, bronkus, paru- paru), saluran reproduksi dan
ginjal. Swab Trachea, swab dilakukan untuk mengambil cairan yang terdapat di
daerah trachea dengan menggunakan cotton swab steril yang dimasukkan ke dalam
trachea ayam sakit, selanjutnya hasil swab dimasukkan ke dalam larutan buffer
posohat saline yang mengandung antibiotic.

Proses isolasi virus sebaiknya dilakukan di dalam Biosafety Cabinet dengan

ruangan yang steril. Ruang steril dan Biosafety Cabinet diperlukan untuk
menghindari kontaminasi baik dari ruangan ke isolat maupun dari isolat ke ruangan
(lingkungan).
 Buang cotton swabnya., kemudian larutan virus disentrifuse dengan 6000 rpm
selama 10 menit, ambil supermatannya dan aliquot kedalam cryogenic tube 1 ml,
jangan lupa diberi label identitas isolate (nama isolate, tanggal isolasi dll). Isolat
disimpan di deep freezer dengan suhu -80 s/d -86 derajat celcius untuk dilakukan
proses selanjutnya seperti isolate pada telur berembrio (sebaiknya telur SPF),
identifikasi, uji sterility test dll.

Alat yang digunakan:

1. BSC (Biosafety Cabinet)

2. Mortar
3. Blender
4. Homogenizer
5. Sentrifus
6. Cryo tube atau Vial

Bahan yang digunakan:

1. Specimen/ sampel organ (isolat/ swab) trachea
2. Phosphate Buffer Salin (PBS)

Cara passase isolate dan perbanyakan virus pada telur berembrio

1. Siapkan telur berembrio, sebaiknya telur SPF berusia 9 sampai 12 hari, buat
lubang pada telur dengan bor pada kantung udara
2. Suntikan isolate sebanyak 0,1 sampai dengan 0,3 mL/butir pada cairan allantois,
tutup dengan selotip. Penentuan umur inkubasi telur itu tergantung hasil dari
optimasi, karena masing- masing virus mempunyai karakteristik yang berbeda
3. Lakukan inkubasi telur yang sudah ditanam virus, inkubasi di inkubator telur
dengan suhu 37°C dengan kelembapan 50 sampai 60%
4. Selanjutnya dilakukan observasi telur (candling) untuk melihat kematian embrio,
kematian embrio akibat virus biasanya antara 17 jam smapai 30 jam post
inokulasi. Disini perlunya memperhitungkan waktu inokulasi supaya telur yang
mati untuk segera di chilling (disimpan pada suhu 4°C) karena telur yang mati
terlalu lama di inkubator akan merusak virus dan mungkin juga kematian virus
5. Panen cairan allantoisnya dari masing- masing teluur
6. Lakukan pengujian kandungan virus untuk mengetahui titer virus
7. Lakukan pengulangan sebanyak minimal 3 kali untuk mengetahui validitas dari
titer virus tersebut
 Hasil Pengamatan:

Keterangan Gambar Telur:

- Kantung udara (air sac) penting untuk pernafasan embrio dan mengatur tekanan
- Kantung telur dan membrane kulit sebagai pertahanan terluar dan mengatur system
pertukaran molekul gas dan cairan
- Kantung chorio alantois, adalah tempat/ wadah untuk cairan alantois yaitu produk
buangan yang dihasilkan oleh perkembangan embrio meningkat sesuai dengan
perkembengan embrio

Hasil Pengamatan :
Pada isolasi virus influenza dibagian alantois telur embrio, didapatkan ± 8ml cairan
yang diduga mengadung virus influenza cairam alantois berubah menjadi keruh yang
megindifikasi virus telah mengindentifikasi telur berembrio

III. PEMERIKSAAN VIRUS INFLUENZA (MENGUKUR TITER HA)

Pertemuan Ke : 3 (tiga)

Hari/Tanggal : Senin, 18 Maret 2019

Dasar Teori :
 Uji Haemagglutination (HA) digunakan untuk mengukur kuantitas titer
virus/antigen. Virus yang bisa dilakukan uji HA hanya virus yang dapat
mengaglutinasi sel darah merah (RBC) seperti virus Newcastle Disease, Avian
Influenza dan virus Egg Drop Syndrome, baik virus yang masih hidup ataupun yang
sudah diinaktifasi (mati). Untuk virus yang masih hidup pengujian HA harus
dilakukan dalam Bio Safety Cabinet (BSC) supaya tidak terpaparnya lingkungan
baik area laboratorium maupun lingkungan luar laboratorium.

Prinsip uji HA adalah terjadinya ikatan antara virus/antigen dengan sel darah
merah yang ditandai dengan adanya agglutinasi (butiran seperti pasir). Pembetukan
aglutinasi ini disebabkan karena adanya ikatan virus/antigen dengan sel darah merah.
Titer virus/antigen dapat diketahui dengan melihat adanya agglutinasi di dasar lubang
microplate (seperti butiran pasir berwarna merah). Pengenceran tertinggi terjadi pada
lubang akhir yang memeberikan agglutinasi, misal terjadi agglutinasi sampei lubang
ke-8, maka titer virus/antigen tersebut adalah lpg 28atau 256 HAU. Untuk
haemagglutinasi yang memberikan hasil negatif (tidak adanya virus/antigen) dapat
diamati apabila microplate dimiringkan 45o sel darah merah (RBC akan turun),
seperti tetesan air mata.

Alat yang digunakan :

1. Multichanel micropipette volume 10 – 50 ml

2. Singlechanel micropipette volume 10 – 50 ml
3. Microtips volume 50 ml
4. Microplate 96 well type V

Bahan yang digunakan :

1. Sampel virus/antigen
2. Pelarut PBS (-) 0,01 M steril, pH 7 - 7,4
3. RBC 1%, cara membuat RBC 1% :
a. Darah yang dipergunakan dalam pembuatan RBC sebaiknya diambil dari ayam
SPF ( Spesific Pathogen Free ) atau SAN ( spesifik antibodi negatif ), artinya
ayam-ayam tersebut tidak mempunyai titer antibodi, umur ayam sebaiknya
 diatas 3 bulan. Darah diambil melalui vena jugularis atau vena brachialis
menggunakan syringe 5 ml yang telah diisi heparin 1:4 ( 1 ml heparin : 4 ml
darah ) atau dapat menggunakan darah EDTA.
b. Keluarkan darah ayam dari syringe dengan hati-hati agar sel darah merah tidak
rusak, sebaiknya jarum terlebih dahulu dilepas dari pistonnya.
c. Centrifuse dengan kecepatan 2500 rpm, 5 menit, 4 o C, kemudian supernatan
dibuang. Tambahkan Nacl fisoligis steril sesuai volume awal, centrifuse
kembali dengan kecepatan 2500 rpm, 5 menit, 4o C.
d. Buang supernatan, tambahkan Nacl fisiologis steril 3 kali volume awal.
Centrifuge lagi dengan kecepatan 2500 rpm, 5 menit, 4o C..
e. Lihat larutan supernatan, bila sudah jernih maka proses centrifugasi bisa
dihentikan lalu buang supernatan, maka kita mendapatkan RBC 100%,
kemudian beri label identitas.
f. Untuk pemeriksan dapat dibuat suspensi eritrosit 10% dulu baru diencerkan
menjadi 1%.

Prosedur :

1. Siapkan micropate, isi masing-masing lubang sumur dari microplate dengan

larutan Nacl 0,85% sebanyak 25 ul.
2. Dengan menggunakan micropipet, tambahkan 25 ul sampel virus/antigen pada
sumur no.1 yang sudah berisi 25 ul Nacl 0,85%.
3. Dengan menggunakan micropipet, homogenkan sumur no.1 , ambil 25 ul dan
masukan ke sumur no.2 kemudian homogenkan. Lakukan langkah ini sampai
sumur no.11 lalu homogenkan, setelah homogen larutan dibuang 25 ul. Sumur
no.12 sebagai kontrol RBC.
4. Tambahkan 25 ul Nacl 0,85% ke dalam semua sumur.
5. Tambahkan RBC 1% ke dalam tiap sumur sampai dengan kontrol RBC (sumur
no.12), kemudian kocok menggunakan mixer atau dengan menggoyang-
goyangkan microplate dengan tangan.
6. Biarkan ( inkubasi ) di suhu ruang selama 45 menit.
7. Baca hasil dengan mengamati pengenceran tertinggi yang memperlihatkan
aglutinasi sempurna, titer ini direpresentasi sebagai 1 HA unit (HAU).
 No 1 2 3 .......... 11 12
Pengenceran 1 2 4 .......... 1048 C
antigen
PBS 25 25 25 25 25 25
Virus 25 25 25 25 25 25
PBS 25 25 25 25 25 25
RBC 1% 25 25 25 25 25 25

Skema Kerja :

Pemgenceran 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 KE
Antigen
NaCl Fisiologis 0,3 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,4

Cairan Alantois 0,1 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 -

NaCL Fisiologis 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 -

Eritrosit 0,5 % 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4

Campur, diinkubasi pada inkubator pada suhu 370C selama 45 – 60 menit

Hasil pengamatan :

Titer 1 UHA = 1/128

 Kesimpulan :

Berdasarkan pemeriksaan penentuan titer HA yang telah dilakukan didapatkan hasil

titer 1 UHA adalah 1/128

Diskusi :

1. Prinsip haemaglutinasi :
Virus mempunyai kemampan untuk mengaglutinasi eritrosit yang di ukur dengan
titer HA.
Ag + Eritrosit 0,5% Haemaglutinasi
2. Makin tinggi pengenceran Ag, makin berkurang kekuatan antigen (Ag) untuk
menyebabkan Haemaglutinasi secara total.
3. Titer HA menunjukkan pengenceran tertinggi dari virus yang masih
mengaglutinasi eritrosit.

IV. PEMERIKSAAN TITER ANTIBODI VIRUS INFLUENZA

(MENGUKUR TITER HI)

Pertemuan Ke : 4 (empat)

Hari/Tanggal : Senin, 19 Maret 2019

Dasar Teori :

Uji Hemaglutination Inhibition (HI) adalah merupakan metode uji serologi

untuk mengetahui kadar/titer antibodi yang terkandung dalam serum pada unggas
yang sudah divaksin atau akibat dari paparan virus lapang. Serum diperoleh dari
darah unggas yang keluar beberapa saat setelah pengambilan, selanjutnya serum di
inaktifasi pada suhu 560C selama 30 menit.
 Keberadaan antibodi dalam jumlah tertentu memperlihatkan efektivitas dari
vaksin dalam memproteksi unggas tersebut dari suatu penyakit.

Prinsip uji Hi adalah menghambat terjadinya aglutinasi sel darah merah (RBC)
oleh virus akibat terikatnya virus tersebut dengan antibodi spesifik. Oleh karena itu
uji HI hanya bisa digunakan untuk virus yang mengaglutinasi RBC (Syukron et al.,
2013) seperti Newcastle Disease, Avian Influenza dan Egg Drop Syndrome.

Proses hemaglutinasi ini terjadi akibat aktivitas hemaglutinin yang terdapat

pada amplop virus tersebut. Aktivitas hemaglutinasi berlangsung maksimal selama
satu jam karena dipengaruhi oleh kerja enzim neuraminidase yang merusak ikatan
pada reseptor eritrosit dengan hemaglutinin dari virus.

Pengamatan nilai titer antibodi dari serum sampel berdasarkan hasil

pengenceran tertinggi (paling encer) yang masih sanggup menghambat aglutinasi
(RBC) oleh antigen.

Titer antibody setiap unggas akan bervariasi karena dipengaruhi oleh beberapa
kondisi seperti jumlah virus yang menginfeksi, kesehatan ayam dan perbedaan waktu
infeksi (Purnamawati dan Sukarnika, 2008).

Alat dan Bahan yang digunakan :

1. Multichanel micropipette volume 10-50 µl

2. Single chanel micropipette volume 10-50 µl
3. Microtips volume 50 µl
4. Microplate type V 96 well
5. Pelarut PBS 0,01 M steril, pH 7,2
6. Serum uji yang telah diinaktifasi pada waterbath 560C selama 30 menit
7. Antigen, titer 4HAU

Cara Kerja :

1. Ke dalam microplate masukan 25 µl PBS , dari sumur no 1 hingga sumur no. 12

2. Tambahkan 25 µl serum uji pada sumur no. 1 yang sudah terisi 25 µl PBS
3. Kocok sampai homogen, ambil 25 µl dari sumur no. 1 dan masukkan ke sumur
no. 2 kemudian kocok. Lakukan step ini sampai dengan sumur no. 11, setelah
 pengocokan pada sumur 11 larutan sampel serum dibuang 25 µl, sumur ke 12
sebagai control RBC
4. Masukkan 25 µl 4HAU antigen ke semua sumur kecuali sumur ke 12, kocok dan
simpan di suhu ruang selama 30 menit
5. Tambahkan 25µl RBC 1 % ke semua sumur
6. Kocok, dengan menggunakan rotator biarkan di suhu ruang 45 menit dan baca
titer antibodinya dengan cara memiringkan plate dengan kemiringan 450
7. Sebagai kontrol negatif dan positif, lakukan pengujian terhadap standar positif
serum dan standar negative serum.

Tabel HI test, HI – test (Titrasi Serum) :

No. Well 1 2 3 ................ 11 12

Pengenceran 1 :2 4 8 ............... 2048 Kontrol
Antigen RBC
PBS 25 µl 25 µl 25 µl ............... 25 µl 25 µl
Serum uji 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl
Antigen 4HAU 25 µl 25 µl 25 µl ............... 25 µl 25 µl
RBC 1% 25 µl 25 µl 25 µl ................ 25 µl 25 µl

Cara Membuat antigen 4 HAU :

1. Sebelum penambahan antigen pada uji HI, antigen tersebut di lakukan uji HA
untuk mengetahui titer awal dari antigen tersebut
2. Lakukan uji HA (Cara mengukur titer HA)
3. Setelah diketahui titer awal dari antigen (misal titernya log 2 9 atau 512) kemudian
untuk mendapatkan 4HAU, antigen diencerkan dengan larutan PBS

Cara Perhitungan :

1. Jika titer antigen 512, maka untuk dijadikan 4 HAU adalah : 512 : 4 = 128 (128
kali)
2. Untuk menjadikan 4 HAU adalah 1 bagian antigen diencerkan dengan 127 bagian
larutan PBS (1 ml antigen + 127 ml PBS)
 3. Untuk memastikan titer antigen 4 HAU, antigen yang telah diencerkan lakukan uji
HA kembali

Skema Kerja :

 Pengenceran Uji HI

Pemgenceran 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280 1/2560 KE KS I/

Antigen KS II
NaCl Fisiologis 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,4 0,2
Serum I/II 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 - 0,2
Antigen 4 UHA 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 - -
Campur, diinkubasi pada suhu ruang selama 20 menit
Eritrosit 0,5 % 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4
Campur, diinkubasi pada inkubator pada suhu 370C selama 45 – 60 menit

 Kontrol Antigen

4 UHA 2 UHA 1 UHA 0,5 UHA

NaCl - 0,2 0,2 0,2
Fisiologis
Ag 4 UHA 0,2 0,2 0,2 0,2
NaCl 0,2 0,2 0,2 0,2
Fisiologis
Eritrosit 0,5 % 0,4 0,4 0,4 0,4

Hasil Pengamatan :

Dari hasil pemeriksaan didapatkan hasil:

Titer SI = 1/40
Titer SII = 1/160
Jadi, uji HI dinyatakan positif
 Kesimpulan :
Dari hasil pemeriksaan/praktikum, didapatkan hasil HI pada serum I dengan
titer 1/40 dan pada serum II didapat titer 1/160, maka diagnosa dikatakan (+) karena
titer serum II > 4x dari titer serum I.
Diskusi :
 Prinsip Hemaglutinasi Inhibisi :
Ag + Ab + eritrosit penghambat Hemaglutinasi (HI)
 Semakin tinggi pengenceran antibodi (Ab) maka akan semakin rendah kekuatan Ab
untuk menghambat Hemaglutinasi secara total
 Tujuan dari uji HI adalah menghambat terjadinya aglutinasi sel darah merah oleh
virus akibat terikatnya virus dengan antibodi spesifik
 Prinsip uji HI : apabila hasil kesimpulan S II > 4x S I maka diagnosa (+)

V. PEMERIKSAAN SEROLOGI VIRUS FLU BURUNG

Pertemuan ke : 5 (lima)

Hari/ Tanggal : Selasa, 19 Maret 2019

Dasar Teori :

Flu burung didefinisikan sebagai penyskit ysng disebabkan oleh virus influenza
A subtype H5N1 yang menyerang burung, unggas, ayam yang menyerang manusia
dengan gejala demam >38°C, batuk, pilek nyeri otot , nyeri tenggorokan , namun,
gejala ini harus diterapkan pada seseorang yang pernah kontak dengan binatang
tersebut dalam 7 hari terakhir. Terutama jika unggas tersebut menderita sakit atau
mati.

Seseorang dinyatakan mengidap flu burung setelah pemeriksaan laboratorium

menunjukan positif untuk virus influenza A (H5) seperti tes anti bodi spesifik pada
spesimen serum . Hasil biakan virus positif influenza A (H5N10 atau hasil dengan
pemeriksaan PCR positif untuk influenza H5. Peningkatan titer antiboodi speifik H5
sebesar >4 kali 7 hasil dengan IFA positif untuk antigen H5.

Gejala flu burung pada dasrnya pada sma dengan flu biasa. Laporan dari kasus
yang terjadi di tahun 1999 menunjukan adanya variasi gejala berupa: Demam sektor
39°C, batuk, lemas, sakit kepala, tidak nafsu makan, muntah, nyer perut, nyeri sendi,
diare, infeksi selaput mata, dan dalam keadaan buruk savere respiratory distrees.

Secara umum metode immunokromatografi untuk mendeteksi sebuah spesimen

dengan mengguanakn dua anti bodi. Antibodi pertama dalam larutan uji atau terdapat
pada membran berpori dan alat uji. Keberadaan antigen akan dikenali oleh antigen
berlebel dengan membentuk katan anigen – antibodi

Prinsip:

Kontrol = Protein spesifik yang berkonjungasi dengan polystyrene latex hijau.

Sampel (+) = Antigen dalam sampel bereaksi menghasilkan konjugasi warna

merah (anti Influenza A monoclomal antibodi- polistryrene micros phere merah)

Cara Kerja:

1. Siapkan alat dan bahan yang akan digunakan

2. Dicelupkan strip test kedalam sampel yang akan diperiksa 1 menit dan jagan
melewati batas max
3. Dibaca strip test yang telah diangkat setelah diyunggu 10 menit dilihat garis
warna.

Interpretasi Hasil:
(+) Positif (-) Negatif Invalid
 Hijau : kontrol
 Merah : Sampel

Hasil pengamatan:

hasil uji dinyatakan negatif

Kesimpulan:
Dari hasil pemeriksaan flu burung dengan menggunakan metode
immunokromatografi dengan menggunakan strip test didapatkan hasil bahwa
 sampel (-) negative atau tidak mengandung antigen flu burung karena hanyan
terbentuk garis warna hijau (control) saja.

Diskusi:
Sampel negative karena dalam serum tidak terdapat antigen virus flu
burung. Sedangkan hasil Invalid disebabkan karena adanya,kemungkinan dalam
salah pengerjaan, misalnya saatmencelupkan strip test kedalam serum melewati
batas max, sehingga menyebabkan hasil invalid atau adanya kesalahan pada strip
test yaitu strip test sudah kadaluarsa tidak dapat digunakan lagi.

Lampiran :