ISOLASI & PEMBIAKAN

VIRUS

Oleh :
Soraya.,S.Si.,M.Sc.
Isolasi virus
• Diagnosa klinis pengambilan
spesimen

 Material Otopsi
Respirasi : Paru-paru & Thrakea
Sistem saraf: otak & sum2 tulang
belakang Jantung : jantung
Pantropik : ginjal, hati & limpa
• Feses : Rectal swab
• Darah
• Cairan tubuh: Cerebrospinal, pericard,
peritoneum & synovial serta eksudat yang
keluar dari mata, hidung maupun mulut
(swab)
• Urine
 PEMBIAKAN VIRUS
• Virus merupakan mikroorganisme yang
bersifat parasit obligat dan hanya bisa
hidup pada media yang hidup.
• Berkaitan dengan sifatnya tersebut, virus
hanya dapat dibiakan pada sel hidup.
• Pemilihan media yang digunakan
tergantung dari jenis virusnya dan organ
target dari virus tersebut.
Untuk menumbuhkan virus dalam rangka
mengisolasi suatu virus dapat dilakukan secara :
1. in ovo yaitu metode menumbuhkan pada media
telur berembrio (telur yang sudah dibuahi)
2. in vivo adalah metode menumbuhkan pada
hewan percobaan sebagai model
3. in vitro yaitu menumbuhkan virus di dalam
gelas- gelas atau tabung menggunakn media
biakan jaringan (tissue culture) atau biakan sel
(cell culture).

.
• Yang paling umum invitro
• Pada hewan  mempelajari sifat
onkogenik virus, patogenesis, reaksi imun
thp virus, pengaruh lingkungan thp infeksi,
isolasi primer thp bbrp jnis virus
• Virus herpes simpleks  skarifikasi
(penggoresan) pd kornea kelinci  kornea
keruh
• Virus rabies  disuntikan intraserebral pd
tikus putih 1-3 hri  ensefalitis  mati
• Dengue  disuntukan intraserebral dan
subkutan pd tikus putih 1-3 hari  3 -7
hari kemudian tremor  paralisis  mati
• Demam- Q  disuntikan intraperitoneal pd
cavia jantan  7-10 hari orkhitis  dalam
cairan skrotum ditemukan penyebab
demam-Q
• Polio  dari tinja, liquor, apus tenggorok
penderita disuntikan pada kera scr
intrakutan/intramuskular/intraneural/
intraspinal  paralisis
Virus Isolation: Telur Embrio Tunas
(TET)

• Telur berembrio telah

lama dan paling
sering digunakan
sebagai media isolasi
dan propagasi atau
pembiakan virus.
• Telur berembrio atau sering disebut
dengan telur embrio tertunas (TET) atau
telur ayam berembrio (TAB) sangat
penting dalam perkembangan virologi
karena pada telur tertunas dapat
ditemukan bermacam-macam tipe sel
yang mampu ditumbuhi/menjadi media
tumbuhnya berbagai jenis virus.
Macam-macam sel tersebut adalah :
1. Sel epitel khorion yang berada pada membran
khorion
2. Sel epitel alantois yang merupakan sel
penyusun pada membran khorioalantaois.
3. Sel epitel amnion yang melapisi ruang amnion
4. sel pada kantong kuning telur ( Yolk sac) dan
sel endotel pada pembuluh darah
5. Sel dari embrionya itu sendiri yang umumnya
adalah sel fibroblast.
Keberhasilan isolasi dan propagasi virus
pada telur dipengaruhi oleh :
 Rute inokulasi
 Umur embrio pada telur
 Temperatur/suhu inkubasi
 Lamanya waktu inkubasi setelah inokulasi
 Volume dan pengenceran inokulum yang
digunakan
 Status kekebalan flok dari induk tempat
telur berasal
Contoh
• Intra-amnion/intra-allantois: herpes
simpleks, influenza, parotitis epidemika 
telur 9-12 hari  pengeraman 24 jam 
suhu 37oC  membentuk antigen
hemaglutinin dan komplemen
• Intra-yolksac: Demam-Q,  telur embrio
6-8 hari  pengeraman 10x24 jam 
suhu 37oC  membentuk antigen ikatan
komplemen
• Intra-yolksac: trakhoma: telur embrio 7-10
hari  pengeraman 1-2 minggu  37oC
 membentuk antigen ikatan komplemen
• Intra-embrional: Japanese B encephalitis
 telur embrio 8-10 hari dan dieramkan
pd suhu 37oC  embrio mati
• Dalam membiakan virus menggunakan
telur, sebaiknya digunakan telur yang
berasal dari breeding flock yang bebas
patogen tertentu (SPF/spesific pathogen
free).

• Telur yang digunakan diinkubasikan pada

suhu 37o dan kelembaban relatif 60-70%.
• Sebelum diinokulasi telur diperiksa
dengan teropong (candling), pemeriksaan
ini dilakukan untuk mengetahui apakah
telur dalam kondisi normal, sesuai dengan
umurnya atau ada kelainan. Kelainan
yang terjadi misalnya tidak adanya
kantung udara, infertile (tidak dibuahi),
embrio lemah atau mati. Telur-telur yang
tidak normal tidak bisa digunakan.
• Inokulasi virus kedalam telur dapat
dilakukan dibeberapa tempat tergantung
jenis virusnya, misalnya pada virus yang
lebih menyukai sel epitel sebagai tempat
berkembang biaknya dapat diinokulasikan
pada membran khorioalantois.
• Rute inokulasi yang dapat dilakukan
antara lain adalah kedalam ruang amnion
(amnionic cavity), ruang alantois (allantoic
cavity), membran khorio alantois, kantong
kuning telur (yolk sac), intravena
(pembuluh darah ) & kedalam otak embrio.
• Dalam menginokulasi virus ke telur selain
rute, umur telur juga harus diperhatikan,
sebab pada umur tertentu, pada daerah
tertentu kondisinya optimal.
• Bila akan menginokulasi kedaerah ruang
amnion , pembuluh darah (intra vena) dan
kantong kuning telur sebaiknya digunakan
telur yang berumur 5-7 hari karena pada
umur tersebut embrio masih muda dan
kecil sehingga kuning telur masih cukup
besar ukurannya demikian juga ruang
amnionnya.
• Untuk menginokulasi ke daerah ruang
alantois dilakukan pada tekur yang
berumur 9-12 hari karena pada saat itu
luas ruang alantois yang optimal dan bila
akan menginokulasi ke membran khorio
alantois sebaiknya pada telur yang
berumur 12-14 hari sebab pada umur
tersebut mambran cukup kuat untuk ditarik
dan dibuat kantung udara buatan.
• contoh pemanfaatan TET misanya untuk
memperbanyak virus ND ataupun Pox.
Pembiakan virus pada kultur sel
Virus dapat diperbanyak dengan melakukan
kultur sel yaitu menumbuhkan sel yang
terinfeksi virus secara invitro.

Why do we need Cell culture?

• Research
– Reduce animal use
• Commercial or large-scale production
– Production of cell material: vaccine, antigen
 Jenis sel asal hewan yang sering digunakan pada kultur sel

CELL LINE* CELL TYPE AND ORIGIN

3T3 Fibroblast (mouse)

293 Kidney epithelium (human)
BHK21 fibroblast (Syrian hamster)
MDCK epithelial cell (dog)
HeLa cancer epithelial cell (human)
PtK1 epithelial cell (rat kangaroo)
L6 myoblast (rat)
PC12 chromaffin cell (rat) (neuroblastoma cell)
SP2 plasma cell (mouse)
COS kidney (monkey)
CHO ovary (chinese hamster)
DT40 (chick) lymphoma cell for efficient targeted recombination
R1 embryonic stem cells (mouse)
E14.1 embryonic stem cells (mouse)
H1, H9 embryonic stem cells (human)
S2 macrophage-like cells (Drosophila)
BY2 undifferentiated meristematic cells (tobacco)
 Pembiakan virus pada kultur sel
Kelebihan :
• Dapat memproduksi dalam jumlah banyak
• Semua jenis virus dapat dibiakan pada kultur sel(
tergantung jenis selnya)
Kekurangannya :
• Biaya lebih mahal
• Pengerjaan harus aseptis
• Perlu peralatan yang lebih kompleks dibanding
pembiakan pada telur
 Pembiakan virus pada hewan
percobaan

• Sudah jarang dilakukan terkait dengan

kesejahteraan hewan
• Penelitian sudah demikian maju, sudah
banyak jenis kultur sel yang dapat
digunakan untuk menumbuhkan virus.
 REAKSI VIRUS TERHADAP
AGEN FISIK & KIMIA
1. Suhu dan Temperatur
• Sebagian besar virus sangat labil dan dapat
hidup diluar tubuh induk semang.
• Di dalam laboratorium harus diusahakan agar
suspensi virus dan jaringan tubuh yang
mengandung virus secepatnya disimpan
pada suhu -40°C atau akan lebih bagus pada
suhu -70°C. Beberapa virus ada yang stabil
pada temperatur kamar serta dapat hidup
dalam waktu yang cukup lama. Misalnya
virus Pox.
• Pengawetan virus yang terbaik adalah
melalui proses pengeringan dalam
keadaan beku, yang disebut dengan
freeze drying. Kebanyakan virus dapat
disimpan berbulan- bulan bahkan
bertahun-tahun pada ampul gelas hampa
udara dalam nitrogen cair (-196°C) atau
pada suhu -70°C sampai -90°C (untuk
virus beramplop).
• Material penyakit yang mengandung virus
harus ditempatkan dalam tabung tertutup
kedap udara bila didinginkan dengan CO2
padat (es kering) untuk menghindari
perusakan virus oleh gas CO2. Sejumlah
virus dapat diinaktifkan oleh proses
pembekuan pencairan (feezing-thawing).

• Sebagian besar virus dapat diinaktifkan pada

suhu 56°C selama 30 menit atau 100°C
selama beberapa detik karena terjadi proses
denaturasi virus.
2. Perubahan pH
• Secara umum sebagian besar virus tetap
hidup pada pH 5-9 akan tetapi virus akan
cepat rusak atau inaktif pada pH yang
terlalu asam atau terlalu basa.
• Asam kuat dan basa kuat menyebabkan
denaturasi protein virus, oleh karena itu
sangat efektif untuk membasmi virus.
Misalnya Natrium hidroksida 2% (caustic
soda) digunakan untuk desinfeksi virus
Penyakit Mulut dan Kuku (PMK).
3. Radiasi Ultraviolet
• Sinar matahari langsung mematikan
mikroorganisme karena mengandung sinar
ultraviolet. Berdasarkan panjang
gelombangnya sinar ultraviolet dapat
dikelompokkan menjadi: 3150-4000A, 2800-
3150A, dan kurang dari 2800A.

• Sinar ultraviolet yang kurang dari 2800A,

mempunyai efek fermisidal (merusak
mikroorganisme) dan dapat menyebabkan
peradangan kulit (erythema) dan peradangan
mata (conjunctivis).
4. Formaldehid

• Larutan formaldehid, yaitu formalin yang

banyak digunakan untuk pembuatan
vaksin inaktif.
• Hanya RNA yang dapat diinaktifkan
dengan formalin
5. Pelarut Lemak
Virus-virus yang mengandung lemak pada
amplopnya dapat diinaktifkan oleh : ether,
kloloform, natrium deoksikolat, fosfolifase, dan
bahan pelarut lemak lainnya.

6. Deterjen
Untuk melarutkan virus beramplop dan sebagai
pembersih alat-alat laboratorium. Untuk
meningkatkan daya penetrasi deterjen dapat
dicampur dengan formalin atau glutaraldehid.
Metode dan bahan kimia yang berbeda
digunakan untuk keperluan inaktivasi yaitu:
A. Sterilisasi : Tekanan uap,pemanasan
kering,oksidasi ethylene,irradiasi sinar g.
B. Disinfeksi permukaan : natrium
hipoklorin, gluataraldehid, formaldehid,asam
pirasetik.
C. Disinfeksi kulit : Klorheksidin, ethanol
70%, iodophore
D. Produksi vaksin :
formaldehid,propiolakton.
CARA MENGAWETKAN VIRUS
1.Temperatur
Kebanyakan virus tahan hidup selama
beberapa hari dalam temperatur 4 C .
keuntungan penyimpanan virus dalam suhu ini
ialah dapat menghindari proses pembekuan
dan pencairan (freeze thawing) suspensi virus
yang dapat merusak partikel virus. Untuk
menyimpan virus dalam waktu lama (
berbulan-bulan atau sampai bertahun-tahun)
digunakan temperatur -70 C (dalam freezer)
atau -196 C (dalam tabung berisi nitrogen cair).
2. Bahan Kimia
a. Jika virus disimpan pada temperatur -70 C,
bahan kimia yang dapat dipakai untuk
mengurangi kerusakan virus adalah DMSO
dengan konsentrasi 10%
b. Bila virus tersebut Cell associated,
disamping DMSO 10%, pada media
penyimpanan virus ditambahkan pula serum
sampai 10% untuk menjaga keutuhan sel.
c. Gliserol sebagai alkohol polihidrat dapat
menstabilkan dinding sel dan partikel virus.
Pada konsentrasi 50% gliserol digunakan untuk
mengawetkan virus pox dan sel epitel yang
mengandung virus PMK.
3. Proses Kering Beku
Cara ini juga disebut liofilisasi dan
merupakan yang terbaik dalam
mengawetkan virus. Virus yang sudah
kering beku dapat disimpan dalam
temperatur 4 C selama berbulan-bulan.
Metode ini digunakan dalam penyimpanan
vaksi aktif.