LAPORAN PRAKTIKUM VIROLOGI

Nama : Beta Lutfi Ayu Nastiti

NIM : 1613353004
Kelas/Kelompok : DIV Analis Kesehatan/9 (Sembilan)
Hari, Tanggal : Jumat, 15 Maret 2019
Materi : Isolasi virus pada telur berembiro
Tujuan : Mendapatkan isolat virus dari hasil isolasi virus pada
telur berembrio
Metode : Isolasi virus pada telur berembrio
Prinsip : Virus influenza di suntikkan pada membran alantois
telur berembrio dan kemudian dilakukan inkubasi dan
dilakukan pemanenan cairan alantois untuk dilakukan uji
selanjutnya
Dasar Teori :
Virus influenza dapat menyebabkan penyakit pada manusia dan hewan. Berbagai
jenis virus influenza antara lain virus influenza type A dengan subtype yang mengandung
aglutinin H terdiri dari H1-H16 dan neuramidase yang terdiri dari N1-N7, juga virus
influenza type B. Virus influenza menyerang manusia dan hewan tergantung subtype nya
dengan menimbukan gejala bersin-bersin, ngorok, sesak napas/megap-megap.
Untuk mendapatkan virus influenza dari pasien yang terkena penyakit adalah degnan
cara mengisolasinya dari organ-organ yang terinfeksi seperti thachea, yaitu sab cairan yang
terdapat di trachea.
Untuk menghindari kontaminasi bakteri sebaiknya organ-organ yang terinfeksi
diambil secara aseptik dan dimasukkan ke dalam larutan buffer phospat saline (media
transport) yang mengandung antiiotik PSK (Penicilin, streptomycin dan Kanamycin) dan
sampai dibawa ke laboratorium dalam keadaan dingin dengan suhu antara 2-8oC.
Pada hewan (ayam) yang terinfeksi sampel dapat diambil dari organ saluran
pernapasan (Trahcea, bronkus, paru-paru), saluran reproduksi dan ginjal. Swab trachea
dilakukan untuk mengambil cairan yang terdapa di daerah trachea dengan menggunaan
cotton swab steril yang dimasukkan ke dalam trachea ayam sakit, selanjutnya hasil swab
dimasukkan ke dalam larutan buffer phospat saline yang mengandung antibiotik.
 Proses isolasi virus sebaiknya dilakukan di dalam biosafety cabinet dengan ruangan
yang steril. Ruang steril dan biosafety cabinet diperlukan untuk menghindari kontamasi baik
dari ruangan ke isolat maupun dari isolat ke ruangan (lingkungan).
Buang cotton swabnya, kemudian larutan virus dicentrifuge dengan 6000rpm selama
10 menit, ambil supernatannya dan aliquot ke dalam cryogenic tube 1 ml, jangan lupa diberi
label identitas isolat (nama isolat, tanggal isolasi dll). Isolat disimpan di deep freezer dengan
suhu -80oC s/d -86oC untuk dilakukan proses selanjutnya seperti passase isolat pada telur
berembrio (sebaiknya telur SPF), identifikasi, uji sterility test, dll.

Pasase Isolat
Untuk perbanyakan virus yang nantinya akan diperunakan sebagai stok virus untuk
keperluan proses selanjutnya seperti Working Seed (WS), identifikasi, pembuatan antigen.
Virus hasil isolasi (isolat) ditumbuhkan pada telur berembrio.

Inokulasi
Virus ditanam pada telur SPF (Spesific Patogenic Free) berembrio dengan masa
inkubasi 9 sampai 12 hari sebanyak 0,1 sampai dengan 0,3 mL/butir. Penentuan umur
inkubasi telur tergantung hasil dari optimasi, karena masing-masing virus mempunyai
karakteristik yang berbeda.

Inkubasi
Telur yang sudah ditanam virus diinkubasi di inkubator telur dengan suhu 37oC
dengan kelembaban 50-60%.

Observasi (Candling)
Selanjutnya dilakukan observasi telur (candling) untuk melihat kematian embrio,
kematian embrio akibat virus AI biasanya antara 17 jam sampai 30 jam post inokulasi. Disini
perlunya memperhitungkn waktu inokulasi supaya telur yang mati untuk segera di chilling
(disimpan pada suhu 4oC) karena telur yang mati terlalu lama di inkubator akan merusak
virus dan mungki juga kematian virus.

Alat yang diperlukan :

1. BSC (Biosafety Cabinet)
 Sebaiknya dalam proses isolasi virus dilakukan dalam BSC supaya virus tidak
menyebar dan hasil isolasi tidak terkontaminasi mikroorganisme lain, seperti bakteri
dan jamur.
2. Mortar
Sebagai alat penghancur/menghaluskan organ (Secara konvensional)
3. Blender
Fungsinya sama dengan mortar, proses akan lebih aseptis
4. Homogenizer
Fungsinya sama dengan mortar/blender, selain lebih aseptis organ akan lebih halus
karena putarannya lebih tinggi dan lebih cepat dari blender.
5. Sentrifuge
Untuk mensentrifuge organ yang sudah di haluskan sehingga terpisahnya cairan virus
(suspensi dan cell organ/sedimen), sentrifuge yang digunakan adalah sentrifuge
refrigerator sehingga dapat di atur pada suhu 2-8oC.
6. Cryo tube atau vial
Mendistribusikan/aliquot suspensi virus

Bahan yang digunakan :

1. Specimen/sample organ (isolat)/swab trachea
Sample organ yang di proses sebaiknya organ-organ yang mempunyai PA yang jelas
dengan asumsi bahwa organ tersebut terinfeksi virus, dalam transfortasinya spesimen
(organ) sebaiknya menggunakan larutan PBS sehingga virus yang ada di dalam sel
tetap hidup.
2. Phospate buffer saline (PBS)
Digunakan PBS dengan pH 7,2-7,4 yang merupakan larutan penyangga yang bai
untuk digunakan dalam proses isolasi virus, karena PBS dapat mempertahankan
konstan pH dan osmolaritas sel.

Cara Kerja :
Cara membuat larutan PBS :
No. Nama Bahan Rumus Kimia Jumlah (g)
1 Natrium Klorida NaCl 8
2 Kalium Klorida KCL 0.2
 3 diNatrium Hydrogenphospat Na2HPO4 1.44
4 Kalium Hydrogenphospat KH2PO4 1.24
5 Air destilasi/air suling/WFI ddH2O 800
6 NaOH 0.1 N
7 HCL 0.1 N

a. Untuk membuat 1 liter larutan PBS, timbang semua bahan di atas dengan
menggunakan Analytic Balance
b. Masukkan ke dalam gelas kimia 1000 ml. Tambahkan 800 ml akuades.
c. Kocok sampai homogen dengan menggunakan magnetic stirer selama 15 menit,
tambahkan akuades sampai volume akhir 1000 ml.
d. pH PBS diperiksa dengan pH meter yang sudah di kalibrasi sebelumnya
e. pH PBS harus menunjukkan 7,2 sampai 7,2 (±0.2). bila pH PBS lebih dari 7,4 maka
tambahkan HCL 0,1 N. Bila pH kurang dari 7,2 maka tambahkan NaOH 0,1 N.
f. Bila pH telah sesuai kocok kembali selama 10 menit agar larutan benar-benar
homogen, kemudian didistribusikan ke dalam botol reagen glass dengan masing-
masing volume 250ml.
g. Sterilkan PBS dengan autoclave, suhu 121oC, selama 15 menit.
h. Bila sudah dingin, beri label kemasan pada botol tersebut dan siman di refrigerator
dengan suhu 2oC-8oC. Pemberian label sangat penting sebagai identitas sehingga tidak
aan terjadi tertukarnya larutan pada saat pemakaian.

Cara Isolasi Virus :

1. Siapkan sample swab trachea atau organ hewan yang terinfeksi dalam larutan PBS
steril
2. Buang cotton swabnya, kemudian larutan virus disentrifuge dengan 6000rpm selama
10 menit, ambil supernatannya dan masukkan ke dalam aliquot cyrogenic tube 1 ml,
jangan lupa diberi label identitas isolat (nama isolat, tanggal isolasi dll)
3. Isolat disimpan di deep freezer dengan suhu -80oC s/d -86oC untuk dilakukan proses
selanjutnya
4. Seperti passase isolat pada telur berembrio (sebaiknya telur SPF), identifikasi, uji
sterility test, dll
Cara passase isolate dan perbanyakan virus pada telur berembrio :
1. Siapkan telur berembrio, sebaiknya telur SPF berusia 9 sampai 12 hari, buat lubang
pada telur dengan bor pada kantung udara
2. Suntikkan isolat sebanyak 0,1 sampai dengan 0,3 ml/butir pada cairan alantois, tutup
dengan selotip. Penentuan umur inkubasi Penentuan umur inkubasi telur tergantung
hasil dari optimasi, karena masing-masing virus mempunyai karakteristik yang
berbeda.
3. Lakukan inkubasi telur yang sudah ditanam virus, diinkubasi di inkubator telur
dengan suhu 37oC dengan kelembaban 50-60%.
4. Selanjutnya dilakukan observasi telur (candling) untuk melihat kematian embrio,
kematian embrio akibat virus AI biasanya antara 17 jam sampai 30 jam post inokulasi.
Disini perlunya memperhitungkn waktu inokulasi supaya telur yang mati untuk segera
di chilling (disimpan pada suhu 4oC) karena telur yang mati terlalu lama di inkubator
akan merusak virus dan mungki juga kematian virus.
5. Panen cairan alantoisnya dari masing-masing telur
6. Lakukan pengujian kandungan virus untuk mengetahui titer virus
7. Lakukan pengulangan sebanyak minimal 3 kali untuk mengetahui validitas dari titer
virus tersebut

Skema Kerja :

1. Tandai bagian 2. Beri tanda titik 1 cm 3. Lubangi telur pada

kantung udara dengan diatas garis kantung titik yang telah di
melihat pada udara. Beri juga label dan tandai dengan bor
teropong telur tanggal isolasi virus listrik/manual
4. Suntikkan suspensi 5. Tutup lubang pada 6. Buka telur pada
virus secara tegak telur dengan batas kantung udara
lurus pada lubang menggunakan selotip. lalu ambil cairan
yang telah dibuat Inkubasi pada 37oC alantoisnya

Hasil Pengamatan :

Kesimpulan :
Pada praktikkum isolasi virus pada telur berembrio didapatkan isolat virus pada cairan
alantois telur untuk digunakan pada uji selanjutnya (uji HA&HI).

Daftar Pustaka :
 Bandar Lampung, 15 Maret 2019

Mengetahui,

Dosen Praktikkan

(Hj. Maria Tuntun Siregar, M. Biomed) (Beta Lutfi Ayu N.)