A.

Pengertian ELISA
ELISA (singkatan bahasa Inggris: Enzyme-linked immunosorbent assay) atau
'penetapan kadar imunosorben taut-enzim' merupakan uji serologis yang umum digunakan
di berbagai laboratorium imunologi. Uji ini memiliki beberapa keunggulan seperti teknik
pengerjaan yang relatif sederhana, ekonomis, dan memiliki sensitivitas yang cukup tinggi.
ELISA diperkenalkan pada tahun 1971 oleh Peter Perlmann dan Eva Engvall untuk
menganalisis adanya interaksi antigen dengan antibodi di dalam suatu sampel dengan
menggunakan enzim sebagai pelapor (reporter label).
Umumnya ELISA dibedakan menjadi dua jenis, yaitu competitive assay yang
menggunakan konjugat antigen–enzim atau konjugat antobodi–enzim, dan non-competitive
assay yang menggunakan dua antibodi. Pada ELISA non-competitive assay, antibodi kedua
akan dikonjugasikan dengan enzim sebagai indikator. Teknik kedua ini seringkali disebut
sebagai "Sandwich" ELISA.

Metode ELISA (enzym-linked immunosorbent assay)

Metode dalam penelitian dengan Berdasarkan : Ikatan spesifik antara antigen (Ag) –
antibody(Ab) terdiri dari :

1. Teknik Qualitatif : Tiap berikatan pada Ag spesifik

2. Teknik Quantitatif : Jumlah Ikatan Ag-Ab ditentukan dengan nilai absorbansi.

Macam sistem metode yang digunakan dalam elisa :

 Direct
 Indirect
 Sandwich
 Capture
B. ELISA Sandwich
Sandwich ELISA mengukur jumlah antigen antara dua lapisan antibodi (yaitu
menangkap dan mendeteksi antibodi). Antigen yang akan diukur harus mengandung
setidaknya dua situs antigenik yang mampu mengikat antibodi, sejak pada setidaknya dua
antibodi bertindak dalam sandwich.
Antibodi monoklonal atau poliklonal dapat digunakan sebagai antibodi penangkap dan
deteksi dalam sistem ELISA Sandwich.Antibodi monoklonal mengenali epitop tunggal
yang memungkinkan deteksi halus dan kuantifikasi perbedaan kecil dalam
antigen. Polyclonal sering digunakan sebagai antibodi penangkap untuk menarik sebanyak
mungkin antigen.
Keuntungan dari Sandwich ELISA adalah bahwa sampel tidak harus dimurnikan
sebelum analisis, dan pengujiannya bisa sangat sensitif (hingga 2 hingga 5 kali lebih
sensitif daripada ELISA langsung atau tidak langsung). Prosedur Sandwich ELISA bisa
sulit untuk dioptimalkan dan menguji antibodi pasangan pasangan harus digunakan. Hal ini
memastikan antibodi mendeteksi epitop yang berbeda pada protein target sehingga mereka
tidak mengganggu pengikatan antibodi lainnya.

Metode Deteksi ELISA Sandwich

Jika antigen target ada dalam sampel maka antibodi pendeteksi akan berikatan dengannya
dan enzim yang terhubung akan dapat bertindak pada substrat dan sinyal akan
dihasilkan. Sinyal ini dapat berupa perubahan warna yang sederhana (chromogenic) atau
penghasil cahaya (chemiluminescenceor fluorescence). Sinyal yang dihasilkan secara
langsung bergantung pada pasangan enzim-substrat yang digunakan untuk deteksi. Tentu
saja, jika antigen tidak ada dalam sampel, maka antibodi deteksi terkait-enzim tidak akan
memiliki apa pun untuk diikat dan tidak ada sinyal yang akan dihasilkan.

Pasangan enzim-substrat yang umum

Ada dua enzim chromogenic yang sangat populer yang digunakan untuk tes ELISA: Horse
radish peroxidase (HRP) dan alkaline phosphatase (ALP). HRP mengkatalisis pembelahan
substrat hidrogen peroksida di hadapan donor hidrogen untuk menghasilkan perubahan
warna. ALP mengkatalisasi perubahan warna P-Nitrophenyl-phospate (pNPP). Sandwich
 chromogenic ELISA dapat diukur dengan mengukur absorbansi. Banyak pasangan
chemiluminescent dan fluorescent enzim-substrat juga tersedia secara komersial dan
mereka membutuhkan fluorometers atau luminometer untuk kuantifikasi.

Prinsip dari Sandwich ELISA adalah sebagai berikut: (1) Pelat dilapisi dengan antibodi
tangkap; (2) sampel ditambahkan, dan setiap antigen yang ada mengikat untuk
menangkap antibodi; (3) mendeteksi antibodi ditambahkan, dan berikatan dengan
antigen; (4) antibodi sekunder terkait-enzim ditambahkan, dan mengikat untuk mendeteksi
antibodi; (5) substrat ditambahkan, dan diubah oleh enzim menjadi bentuk yang dapat
dideteksi.

Protokol umum adalah sebagai berikut:

1. Oleskan sampel antigen yang dikenal ke permukaan, sering di dalam sumur piring mikrotiter.
Antigen dipasangkan ke permukaan untuk membuatnya tidak bergerak.

2. Sumur pelat atau permukaan lainnya kemudian dilapisi dengan buffer pemblokir.

3. Mendeteksi antibodi, biasanya diencerkan dalam buffer pemblokiran, diterapkan pada pelat
untuk mengikat antigen yang dilapisi pada pelat.

4. Piring dicuci, sehingga antibodi yang tidak terikat dihapus. Setelah pencucian ini, hanya
kompleks antibodi-antigen yang menempel pada sumur.

5. Antibodi kedua, yang akan berikatan dengan kompleks antigen-antibodi apa pun, ditambahkan
ke dalam sumur. Antibodi kedua ini digabungkan ke enzim pengubah substrat.

6. Cuci piring, sehingga kelebihan antibodi yang tidak terikat dikeluarkan.

7. Terapkan substrat yang diubah oleh enzim untuk memperoleh sinyal chromogenic atau
fluorescent.

8. Lihat / ukur hasilnya menggunakan spektrofotometer atau perangkat optik lainnya.