Nama : Bella Novalindo

Nim : 1534037
Tugas : Virologi

TES HEMAAGLUTINASI INHIBISI

A. Tujuan
Untuk mengetahui kenaikan titer zat anti hemaglutinin selama sakit
B. Metode
Metode hemaglutinasi inhibisi menggunakan makroplate
C. Prinsip
Antigen virus antibodi serum dan eritrosit ditambahkan dengan
perbandingan yang sama sehingga terjadi ikatan antigen dan antibodi saja ,
tidak terjadi ikatan antara antigen dengan eritrosit . Sehingga tidak terbentuk
hemaglutinasi , hal ini menunjukkan tes hemaglutinasi inhibisi positif
D. Dasar Teori
Virus adalah parasit berukuran mikroskopik yang menginfeksi sel
organisme biologis. Virus bersifat parasit obligat, hal tersebut disebabkan
karena virus hanya dapat bereproduksi di dalam material hidup dengan
menginvasi dan memanfaatkan sel makhluk hidup karena virus tidak memiliki
perlengkapan selular untuk bereproduksi sendiri. Biasanya virus mengandung
sejumlah kecil asam nukleat (DNA atau RNA, tetapi tidak kombinasi
keduanya) yang diselubungi semacam bahan pelindung yang terdiri atas
protein, lipid, glikoprotein, atau kombinasi ketiganya. Genom virus akan
diekspresikan menjadi baik protein yang digunakan untuk memuat bahan
genetik maupun protein yang dibutuhkan dalam daur hidupnya. stilah virus
biasanya merujuk pada partikel-partikel yang menginfeksi sel-sel eukariota
(organisme multisel dan banyak jenis organisme sel tunggal), sementara istilah
bakteriofage atau fage digunakan untuk jenis yang menyerang jenis-jenis sel
prokariota (bakteri dan organisme lain yang tidak berinti sel). Virus sering
diperdebatkan statusnya sebagai makhluk hidup karena ia tidak dapat
 menjalankan fungsi biologisnya secara bebas jika tidak berada dalam sel
inang. Karena karakteristik khasnya ini virus selalu terasosiasi dengan
penyakit tertentu, baik pada manusia (misalnya virus influenza dan HIV),
hewan (misalnya virus flu burung), atau tanaman (misalnya virus mosaik
tembakau/TMV).(wikipedia, 2011)
Tes aglutinasi dapat dimodifikasi untuk pemeriksaan antigen yang
terlalut, tes ini disebut hemaglutinasi inhibisi . disebut hemaglutinasi inhibisi
karena dapat mengukur kemampuan antigen yang terlarut untuk menghambat
aglutinasi antara antigen dengan eritrosit oleh antibodi. Jika sempel
mengandung antigen, antigen terlarut akan bersaing dengan eritrosit untuk
berikatan dengan antibody, sehingga menghambat aglutinasi sel darah merah
dengan menipiskan atau mengencerkan sample, anda dapat menghitung
jumlah antigen melalui titer pada sempel yang belum diketahui . (Mayer,
2010)
 Reaksi:

oooo O O XXXX
XXXX XXXX
O O
oooo XXXX
O O XXXX
XXXX
oooo O O
Antibodi Ikatan Eritrosit +
Eritrosit nonhemaglutinasi
spesifik antigen-
antigen 0,5%
antibodi positif
+ +

E. Alat dan Bahan

1. Alat
 Spuit
 Tabung reaksi
 Alas untuk ayam
 Sentrifuge
 Tabung mikrohematokrit
 Mikrohematrokrit reader
 Erlenmeyer
  Mikro well
 Tabung dengan tutup
2. Bahan
 Ayam hidup
 Darah ayam
 EDTA
 NaCl
 Suspesi darah 1%
 Larutan PBS (Phospat Buffer Saline)
 Virus Ab ND
 Virus ND inaktif
- Ab
F. Cara Kerja
1. Pengambilan darah ayam
a. Alat dan bahan disiapkan di atas meja praktikum
b. Spuit ditambahkan EDTA kurang lebih 0,2 ml
c. Ayam diletakkan diatas alas
d. Pengambilan darah ayam dilakukan oleh 2 orang
e. Kaki dan 1 sayap ayam dipegang
f. Phlebotomis memegang sayap ayam yang akan diambil darahnya
pada bagian bawah sayap ayam.
g. Darah ayam diambil dengan menusukkkan jarum spuit pada
daerah dekat vena ayam kemudian menusukkan pada vena ayam.
h. Darah ayam diambil sebanyak 3 cc
i. Darah ayam ditampung di tabung dengan EDTA
2. Pencucian Eritrosit Ayam
a. Darah pada tabung EDTA disentrifugasi 3000 rpm selama 2 menit
b. Supernatan dibuang
c. Darah ditambahkan NaCl sampai ¾ tabung
d. Sentrifugasi 3000 rpm selama 2 menit
e. Supernatan dibuang
 f. Darah ditambahkan NaCl sampai ¾ tabung
g. Sentrifugasi 3000 rpm selama 2 menit
h. Supernatan dibuang
i. Darah ditambahkan NaCl sampai ¾ tabung
j. Sentrifugasi 3000 rpm selama 2 menit
k. Suspensi ayam 100% siap digunakan
3. Pemeriksaan PCV darah ayam
a. Alat dan bahan dipersiapkan di atas meja
b. Tabung mikrohematokrit dimasukkan pada tabung EDTA dengan
memiringkan tabung EDTA
c. Tabung mikrohematokrit di tambahkan sabun pada bagian
ujungnya dengan menancapkan pada sabun
d. Sentrifugasi pada kecepatan 7500-15000 rpm selama 5 menit
e. Hasilnya dibaca pada mikrohematokrit reader
4. Pembuatan Suspensi darah ayam 1%
a. Pembuatan suspensi ayam 1% dilakukan dengan pengenceran dari
suspensi ayam 100% (Hasil pemeriksaan PCV yaitu 25)
b. Pengenceran dilakukan dengan
c. Penambahan 24 ml NaCL ditambah 1 ml suspensi eritrosit ayam
100%
d. Dihomogenkan
e. Suspensi eritrosit ayam 1% siap digunakan
5. Pemeriksaan Hemaglutination Inhibition (HI) Virus ND (Newcastle
Disease)
a. Pada lubang A (1-12) ditambahkan 25 mikron PBS
b. Pada lubang A1 ditambahkan 25 virus Ab ND
c. Dilakukan pengenceran:
Dilakukan pemipetan pada lubang 1 secara tarik mundur sebanyak
3 kali kemudian dipipet 25 mikron dan dipindahkan ke lubang 2
d. Pada lubang 11 ditambahkan 25 mikron virus ND inaktif
e. Inkubasi 30 menit
 f. Ditambahkan pada semua lubang A (1-12) 50 mikron eritrosit
ayam 1%
g. Digoyang pada shaker selama 30 detik
h. Diinkubasi 15 – 30 menit

Interpretasi Hasil:
(+) = mengendap
(-) = menyebar
 Uji Haemaglutination (HA)

A. Tujuan
Hemaglutination (HA test) Untuk mengetahui titer virus
B. Uji Haemaglutination (HA)
digunakan untuk mengukur titer virus/antigen secara kuantitas.
Virus yang bisa dilakukan uji HA hanya virus yang dapat mengaglutinasi
sel darah merah (RBC) seperti virus Newcastle Disease, Avian Influenza
dan virus Egg Drop Syndrome, baik virus yang masih hidup ataupun yang
sudah diinaktifasi (mati), hanya saja untuk virus yang masih hidup
pengujian HA harus dilakukan di dalam Bio Safety Cabinet (BSC) supaya
tidak terpaparnya lingkungan baik area laboratorium maupun lingkungan
luar laboratorium.
C. Prinsip uji HA
terjadinya ikatan antara virus/antigen dengan sel darah merah yang
ditandai dengan adanya agglutinasi (butiran seperti pasir). Pembentukan
agglutinasi ini disebabkan karena adanya ikatan virus/antigen dengan sel
darah merah. Titer virus/antigen dapat diketahui dengan melihat adanya
agglutisai di dasar lubang dari microplate pada lubang
terakhir/pengenceran tertinggi, misal terjadinya agglutinasi sampai lubang
ke 8, maka titer virus/antigen tersebut adalah log 28 atau 256 HAU,
sementara untuk well yang negatif (tidak adanya virus/antigen) apabila
microplate dimiringkan 45 derajat sel darah merah (RBC) akan turun
D. Alat dan Bahan
Alat dan bahan yang diperlukan dalam pengujian HA diantaranya :
1. Multichanel micropipette volume 10 –50 ml
2. Singlechanel micropipette volume 10 –50 ml
3. Microtips volume 50 ml
4. Micropalte 96 well type V
5. Sampel virus/antigen
 6. Pelarut PBS (-) 0,01 M steril, pH 7-7.4 (Cara Pembuatan larutan
PBS)
7. RBC 1 % (Cara Pembuatan RBC)

E. Prosedur

1. Masing-masing well dari microplate, diisi larutan PBS (-) sebanyak

0,025 ml.
2. Dengan menggunakan Singlechanel micropipette, tambahkan
0,025 ml sampel virus/antigen pada well no.1 yang sudah terisi
0,025 ml PBS
3. Dengan menggunakan multichannel, kocok well no 1 sampai
homogen, ambil 0,025 ml dan masukan ke well no. 2 kemudian
kocok. Lakukan langkah ini sampai dengan well no 11, pada well
11 setelah pengocokan larutan di buang 0,025 ml. Well no 12
sebagai kontrol RBC.
4. Tambahkan 0.025 mL PBS (-) ke dalam semua well.
5. Tambahkan RBC 1% kedalam tiap well sampai dengan control
RBC (well no 12), kemudian kocok memakai mixer atau dengan
menggoyang-goyangkan microplate dengan tangan.
6. Biarkan di suhu ruang 45 menit. Baca hasilnya dengan mengamati
pengenceran tertinggi yang memperlihatkan aglutinasi sempurna,
titer ini direpresentasi sebagai 1 HA unit (HAU).
 Uji Netralisasi Virus

Uji netralisasi virus dapat digunakan untuk mengukur titer antibody secara
kuantitatif. Selain itu uji netralisasi dilakukan juga dalam idetifikasi virus yang
tidak diketahui dengan menggunakan antisera yang sudah diketahui. Uji
netralisasi terdiri dari dua tahap. Tahap pertama adalah virus dengan titer tertentu
direaksikan dengan serum pada beberapa titer tertentu didalam sebuah tabung uji.
Campuran virus dan serum diinkubasi bersama pada temperatur standar untuk
jangka waktu tertentu. Tahap kedua, dilakukan pembiakan virus-virus yang tidak
ternetralisasi ke sistem indikator (media biakan). Setelah diinkubasikan dilakukan
pengamatan terhadap hasil pembiakan.
Serum yang akan diuji netralisasi harus disterilkan dahulu, bebas bahan
kimia dalam penyimpanannya (phenol, formalin dan lainnya), serta telah
diinaktivasi. Inaktivasi dilakukan dengan pemanasannya 560C selama 30 menit,
pemanasan tersebut akan merusak substansi nonspesifik penghambatnya yang
menghambat reaksi Ab dengan virus.
Strain virus yang digunakan untuk uji netralisasi harus mempunyai titer
yang tinggi, tidak serumpun dengan virus uji, serta adaptasinya sangat baik
dengan metode yang digunakan. Virus yang digunakan juga harus murni dan
bebas dari bakteri, fungi, atau mikoplasma. Sebagai pelarut dapat digunakan
media kultur sel.
Prosedur uji netralisasi yang digunakan atau dikenal saat ini yaitu Prosedur
uji netralisasi yang digunakan atau dikenal saat ini yaitu prosedur uji netralisasi-ß
dan prosedur uji netralisasiα(Swayne etal.1998). Pada uji netralisasi - ß, serum
yang diuji diencerkan secara seri atau desimal dan virus standarnya bertiter tetap.
Uji ini memiliki keuntungan yaitu volume serum uji yang digunakan sedikit. Pada
uji netralisasi-α virus diencerkan secara serial serta diencerkan dengan serum tetap
pada titer tertentu (tampa pengencer). Campuran virus dan serum diinkubasi dan
dihitung untuk residual virus yang terkandung didalamnya yang dinyatakan
dengan Lethal Dose 50(LD50) atau Infectious Dose 50(ID50).