HEMAGLUTINATION

INHIBITION TEST
Tujuan:
Untuk mengetahui titer antibodi secara kuantitatif yang
menunjukkan tingkat kekebalan (protektifitas) terhadap agen
penyakit ND dan AI dan untuk evaluasi hasil vaksinasi

Bahan dan Alat Uji HA/ HI Test:

Sampel/ contoh : Serum darah
Bahan :
PBS concentrate solution
Alsever (anti coagulan)
Alcohol 70%
Iodine
Antigen AI (H5N1)
Antigen ND
serum
Chicken red blood cell (sel darah merah ayam)
dll
Alat:
Micro plate V bottom 96 well
Single channel micropipette 0,025 ml – 0,050 ml
Multi chanel micropipette 0,025 ml – 0,050 ml
Electric centrifuge
Erlenmeyer 100 ml
Micro tips 0,025 ml
Micro tube rack
Water bath
Disposible syrink 3 ml
Glove free powder
Mask
Paper towel (tissue)
Tabung reaksi
Pipette
Tempat reagen
Tata Cara Pengujian

a. Persiapan sampel serum

Serum berasal dari ayam yang akan di uji HI

1. Darah diambil dari vena axylaris atau vena jugularis dengan spuit 3 cc,
jarum 23G
2. Setelah darah membeku, disimpan disuhu ruang atau 4ºC semalam
3. Serum dipisahkan dan diinaktivasi pada suhu 56ºC selama 30 menit
4. Siapkan serum standar positif yang telah diketahui titernya dan serum
standar negatif yang tidak mengandung antibodi terhadap ND/ AI
b. Persiapan sel darah merah ayam/ red blood cell 0,5% (RBC)

1. Darah diambil dari ayam yang tidak mengandung Ab terhadap ND/

AI
2. Penambahan antikoagulan alsever 1:1
3. Disentrifus kecepatan 1500 rpm selama 10 menit
4. Supernatan dan WBC dibuang, endapan ditambah PBS pH 7,2
bebas Ca dan Mg, sebanyak 10x volume darah dan diaduk perlahan
dan merata
5. Sentrifus kembali 1500 rpm, 10 menit. Pencucian diulang minimal 3x
6. Endapan RBC dilarutkan dalam PBS steril
c. Pengujian HA

1. Isi microplate dengan PBS sebanyak 0,025 ml pada lubang 1 – 12

2. Masukkan antigen ND/ AI pada lubang 1 sebanyak 0,025 ml,
kemudian diencerkan dengan cara dikocok, kemudian diambil
0,025 ml dan dimasukkan ke lubang 2 dan di kocok lagi dan
diambil 0,025 ml masukkan ke lubang 3 begitu seterusnya
sampai lubang 12 kemudian setelah sampai lubang 12 lalu
dibuang
3. Kemudian isi PBS sebanyak 0,025 ml pada lubang 1-12
4. Setelah itu isi RBC 0,5% sebanyak 0,025 ml pada lubang 1-12,
setelah digoyang-goyang (menggunakan tangan) selama 1
menit dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar
5. Gunakan kontrol positif (lubang berisi Ag virus) dan kontrol negatif
(lubang tanpa Ag virus)
6. Setelah 30 menit baca hasilnya
Analisa hasil Uji HA

1. Titer HA dinyatakan dalam log 2

2. Titer HA dibaca dengan cara menegakkan plate dan
mengamati ada tidaknya aliran (tear drop) SDM. Titer HA
dibaca berdasarkan pengenceran tertinggi yang
memberikan HA sempurna (tidak ada streaming/
aglutinasi).
Atau penghitungan titer HA unit dilakukan dengan
menghitung lubang yang aglutinasi pekat (lubang 1) sampai
lubang terakhir yang masih aglutinasi (misal lubang ke 9)
3. Kontrol positif: aglutinasi sempurna, kontrol negatif: RBC
mengendap
Analisa hasil Uji HA

4. Cara membuat 4HAU yaitu pengenceran tertinggi dibagi

dengan 4
Misalnya diperoleh titer HA 2 pangkat 9= 512. 4HAU nya
adalah 512:4= 128. Sehingga untuk membuat 4HAU dengan
cara mengencerkan 1 bagian stok antigen 512 HA, dengan
PBS 127 bagian.
Misal membuat sebanyak 25000 µl (25 ml) dengan cara
mencampurkan antigen 25000:128= 195,3 (dibulatkan 196) µl
dengan PBS 25000-196= 24.804 µl.
Jadi untuk membuat 4HAU sebanyak 25000 µl, dibutuhkan
196 stok antigen 512 HA dengan PBS 24.804 bagian
c. Pengujian HI
1. Isi microplate dengan PBS dengan volume 0,025 ml pada semua
lubang pada mikroplat
2. Masukkan serum pada lubang di baris 1A-F sebanyak 0,025 ml
kemudian diencerkan dengan cara dikocok kemudian diambil 0,025 ml dan
dimasukkan ke lubang 2 dan dikocok lagi dan diambil 0,025 ml masukkan
ke lubang 3 begitu seterusnya sampai lubang 11. 1G kontrol negatif. 1H
kontrol positif Ab
3. Lubang 12 diisi serum 0,025 ml, lubang 12 sebagai kontrol serum.
4. Masukkan antigen 4 HAU sebanyak 0,025 ml pada lubang 1-12
5. Inkubasi 30 menit. Kemudian diisi RBC 0,5% sebanyak 0,050 ml pada
lubang 1-12 kemudian digoyang-goyang (menggunakan tangan) 1 menit
dan diinkubasi selama 30 menit
7. Setelah 30 menit baca hasilnya
d. Tahapan Analisa
1.Titer HI dibaca dengan cara menegakkan plate dan mengamati ada
tidaknya aliran (tear drop) SDM. Titer HI adalah angka pengenceran
tertinggi dimana hambatan aglutinasi dibaca dengan menegakkan plate.
Hanya well yang mengalami stream pada waktu yang sama, dapat dinilai
sebagai hambatan aglutinasi.
Atau penghitungan titer HI dilakukan dengan menghitung lubang yang tidak
aglutinasi (mengendap; lubang 1) sampai lubang terakhir tidak aglutinasi
(misal lubang ke 6) maka titer HI dinyatakan dengan nilai 2 pangkat 6 atau
64.
 2. Titer HI dapat dinyatakan positif bila terjadi
hambatan aglutinasi pada pengenceran serum 1/16
atau 1:16 (24 ) atau lebih terhadap antigen 4 HAU
(untuk hasil HI test AI)
3. Titer HI dapat dinyatakan positif bila terjadi
hambatan aglutinasi pada pengenceran serum 1/64
atau 1:64 (26 ) atau lebih terhadap antigen 4 HAU
(untuk hasil HI test ND)

Uji Konfirmasi
Titer antibodi tinggi (protektif) terhadap AI adalah ≥ Log 24
Titer antibodi tinggi (protektif) terhadap ND adalah ≥ Log 26