Elisa & Elektroforesis

• SHERRIN KARINA P ( 3181029 )

• TIKA VERA A ( 3181030 )
• YAYI AULLIA R ( 3181031 )
A. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
Adalah teknik Biokimia yang digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi
atau antigen dalam suatu sampel.
1.Prinsip Dasar ELISA :
• Enzim digunakan untuk mendeteksi pengikatan antigen-antibodi
• Enzim mengubah substrat tak berwarna menjadi produk berwarna, menunjukkan adanya kompleks
antibodi-antigen
• ELISA dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan antigen atau antobodi
2. JeniS Jenis ELISA
1. Direct ELISA
Untuk deteksi langsung, antigen yang dilapisi ke pelat multi-well dideteksi oleh antibodi yang telah langsung
terkonjugasi ke enzim. Metode deteksi ini adalah pilihan yang baik jika tidak tersedia secara komersial ELISA kits
untuk protein target Anda.
1. Keuntungan
• Cepat karena hanya satu antibodi dan lebih sedikit langkah yang digunakan.
• Reaktivitas silang antibodi sekunder dihilangkan.
2. Kekurangan
• Immunoreactivity dari antibodi primer mungkin terpengaruh dengan pelabelan dengan enzim atau tag.
• Pelabelan antibodi primer untuk setiap sistem ELISA spesifik memakan waktu dan mahal.
• Tidak ada fleksibilitas dalam memilih label antibodi primer dari satu eksperimen ke eksperimen lainnya.
• Amplifikasi sinyal minimal.
2. Indirect ELISA
Untuk deteksi tidak langsung, antigen yang dilapisi ke pelat multi-well dideteksi dalam dua tahap atau lapisan.
Pertama sebuah antibodi primer tidak berlabel, yang khusus untuk antigen, diterapkan. Selanjutnya, sekunder
berlabel enzim antibodi terikat pada antibodi pertama. Antibodi sekunder biasanya antibodi anti-spesies dan
sering poliklonal.
A. Tahapan indirect ELISA :
1. Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya ditempelkan pada lubang plate
mikrotiter. Sampel dari konsentrasi antigen akan menetapkan kurva standar yang digunakan untuk
mengkalkulasi konsentrasi antigen dari sampel yang diuji.
2. Serum test ditambahkan dalam semua lubang plate mikrotiter. Dikenal sebagai bloking karena serum
memblok adsorpsi non spesifik dari protein lain ke plate.
3. Plate dicuci, kemudian antibodi pendeteksi yang spesifik dimasukkan dalam lubang. Antibodi ini hanya
akan mengikat antigen terimobilisasi pada permukaan lubang, bukan pada protein serum yang lain atau
yang terblok.
4. Antibodi sekunder ditambahkan dalam lubang, yang kemudian akan berkonjugasi menjadi
substrat menjadi enzim dengan susbtrat spesifik.
5. Plate dicuci untuk membuang konjugat yang tidak terikat.
6. Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh enzim untuk mendapatkan sinyal.
7. Hasil dikuantifikasi dengan ELISA reader, atau alat optik/ elektrokimia lainnya.
Keuntungan
• Berbagai macam antibodi sekunder berlabel tersedia secara komersial.
• Serbaguna karena banyak antibodi primer dapat dibuat dalam satu spesies dan label sekunder yang sama
antibodi dapat digunakan untuk deteksi.
• Maksimum immunoreactivity dari antibodi primer dipertahankan karena tidak berlabel.
• Sensitivitas meningkat karena masing-masing antibodi primer mengandung beberapa epitop yang dapat
diikat oleh
• antibodi sekunder berlabel, memungkinkan untuk penguatan sinyal.Kekurangan
• Reaktivitas silang mungkin terjadi dengan antibodi sekunder, menghasilkan sinyal nonspesifik.
• Langkah inkubasi ekstra diperlukan dalam prosedur.
3. ELISA Kompetitif
• Prinsip dasar dari teknik ini adalah menambahkan suatu kompetitor ke dalam lubang mirotiter. Teknik
ELISA Kompetitif ini dapat diaplikasikan untuk mendeteksi keberadaan antigen atau antibodi.
• Tahapan ELISA Kompetitif :
1. Mikrotiter diisi dengan antibodi spesifik yang dapat berinteraksi dengan antigen yang diinginkan
sehingga antibodi spesifik tersebut dapat menempel pada dinding lubang mikrotiter.
2. Mikrotiter dibilas untuk membuang antibodi spesifik yang tidak menempel pada dinding lubang.
3. Tambahkan larutan sampel yang mengandung antigen spesifik yang sudah ditautkan dengan enzim
singnal dan larutan sampel yang mengandung antigen diinginkan. Sehingga terjadi kompetisi antara
antigen spesifik tertaut signal dengan antigen yang diinginkan yang berinteraksi dengan antibodi
spesifik.
4. Bilas mikrotiter untuk membuang antigen yang tidak berinteraksi dengan antibodi.
5. Lalu kedalam lubang lubang ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal yang
tertaut dengan antibodi spesifik. Sehingga menghasilkan signal yang dapat dideteksi.
• Kelebihan ELISA Kompetitif :
Tidak diperlukannya purifikasi terhadap larutan sampel yang mengandung antibodi atau antigen yang
mengandung antibodi atau antigen yang diinginkan. Tetapi hasil yang diperoleh tetap memiliki tingkat
sensitivitas tinggi akibat sifat spesifitas dari antibodi dan antigen.
4. ELISA Non-Kompetitif / Sandwich ELISA
• Prinsip dasar kerja ELISA Non-Kompetitif / Sandwich ELISA mirip dengan ELISA direct. Hanya saja pada Sandwich
ELISAlarutan antigen yang diinginkan tidak perlu dipurifikasi. Namum karena antigen yang diinginkan harus dapat
berinteraksi dengan antibodi primer spesifik dan antibodi sekunder spesifik. Maka teknik Sandwich ELISA
cenderung dikhususkan pada antigen yang memiliki minimal 2 sisi antigenic atau antigen yang bersifat mutivalent.
• Tahap Sandwich ELISA :
1. pertama microtiter diisi dengan larutan yang mengandung antibodi penangkap, sehingga dapat menempel pada
bagian dinding lubang microtiter.
2. Selanjutnya microtiter dibilas untuk membuang antibodi penangkap yang tidak menempel pada dinding lubang
microtiter.
3. Kemudian larutan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang
microtiter, sehingga terjadi interaksi antara antibodi penangkap dengan antigen yang diinginkan.
• Selanjutnya, microtiter kembali dibilas untuk membuang antigen yang tidak berinteraksi dengan
antibodi penangkap.
• Lalu, kedalam lubang microtiter dimasukkan larutan yang berisi antibodi detektor, sehingga pada
lubang microtiter tersebut terjadi interaksi antara antigen yang diinginkan dengan antibodi detektor.
• Selanjutnya microtiter dibilas lagi untuk membuang antibodi detektor yang tidak berinteraksi
dengan antibodi spesifik.
• Kemudian pada tahap akhir ELISA indirect, ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim
signal, lalu enzim yang tertaut pada antibodi detektor yang telah berinteraksi dengan antigen yang
diinginkan akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi
Kelebihan Sandwich ELISA
• Spesifisitas tinggi: antigen / analit secara spesifik ditangkap dan dideteksi.
• Cocok untuk sampel yang kompleks (atau mentah / tidak murni): antigen tidak memerlukan
pemurnian sebelum pengukuran.
• Fleksibilitas dan sensitivitas: metode deteksi langsung atau tidak langsung dapat digunakan.
5. ELISA Biotin Streptavidin (Jenis ELISA modern)
• Sandwich ELISA juga dikembangkan untuk mendeteksi antibodi dengan tingkat sensitivitas relatif lebih
tinggi. Teknik ini dikenal sebagai teknik ELISA penangkap antibodi, dimana prinsip kerjanya sama dengan
ELISA sandwich, hanya saja yang digunakan pada teknik ini adalah antigen penangkap dan antigen detektor
(antigen bertaut enzim signal, bersifat optional apabila antibodi yang diinginkan tidak tertaut dengan enzim
signal).
• Contoh dari aplikasi teknik ini adalah teknik ELISA untuk mendeteksi vitamin biotin yang tertaut dengan
suatu antibodi avidin dengan mengubah antibodi avidin menjadi antibodi streptavidin, dimana satu molekul
streptavidin dapat mengikat empat molekul biotin (pengembangan dari ELISA indirect), sehingga signal
yang teramplifikasi menjadi semakin kuat akibat interaksi antara biotin dengan enzim yang menjadi
semakin banyak.
6. ELISA Multiplex
Teknik ELISA ini merupakan pengembangan teknik ELISA yang ditujukan untuk pengujian secara
simultan, sedangkan prinsip dasarnya mirip dengan teknik ELISA terdahulu.
Aplikasi Teknik ELISA
1. Pemeriksaan donor darah untuk pembuktian 4. Pendeteksian Infeksi
adanya kontaminasi virus: • Agen penularan secara seksual, HIV, Syphilis dan
• HIV-1 dan HIV-2 (keberadaan antibody anti-HIV) Chlamydia
• Hepatitis C (presence of antibodies) • Hepatitis B dan C
• Hepatitis B (test untuk keberadaan antibody dan • Toxoplasma Gondii
antigen virus) 5. Pendeteksian bahan allergen pada makanan dan
• HTLV-1 dan -2 (keberadaan entibodi) debu rumah.
2. Pengukuran level hormone 6. Pendeteksian keberadaan zat obat-obatab terlarang,
• hCG (sebagai tes kehamilan) seperti
• LH ( menentukan waktu ovulasi) • Cocain
• TSH, T3dan T4 (untuk fungsi thyroid) • Opium
• 9-tetrahydrocannabiol, campuran aktif pada marijuana.
Hal yang perlu di kalibrasi pada ELISA
1. Elisa Reader
• Yang perlu dikalibrasi adalah :
a. Liniaritas alat
b. Stabilitas pembacaan
c. Ketepatan pembacaan
• Kalibrasi harus dilakukan saat:
a. Pertama kali alat tersebut dipakai
b. Setelah penggantian lampu
c. Secara berkala untuk ketepatan pembacaan
• Cara kalibrasi sangat bervariasi, tergantung merek dari alat, untuk itu perlu mengikuti petunjuk yang terdapat pada
masing – masing alat.
2. ELISA Washer
Yang perlu dikalibrasi pada alat ini adalah :
a. Volume dispenser
Waktu dispensing, volume di dalam washer harus sesuai dengan sertifikasi
masing – masing alat. Apabila volume tidak tepat, di kalibrasi sesuai
dengan petunjuk yang ada pada alat.
b. Sisa yang tertinggal dalam sumur (rest volume)
Sisa yang tertinggal tidak boleh melebihi volume yang ditentukan untuk
masing – masing alat. Apabila volume melebihi volume yang ditentukan
maka alat perlu di kalibrasi.
c. Posisi lubang
Hal – hal yang perlu diperhatikan yaitu pada waktu dispensing atau
asperasi, bagian head tidak boleh menyentuh tepi atau dasar lubang.
B. Elektroforesis
Pengertian

Elektroforesis adalah teknik pemisahan molekul bermuatan berdasarkan

perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik.
Prinsip kerja
Prinsip kerja elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel partikel bermuatan negatif ( anion )
menuju kutub positif ( anode ) dan juga sebaliknya.
Elektroforesis digunakan untuk mengamati hasil amplifikasi dari DNA.
Jenis Jenis elektroforesis
1. Elektroforesis Kertas
Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase diam dan partikel
yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ion-ion kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya
gradasi konsentrasi sepanjang system pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada
muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit,
kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorbsivitas zat terlarut.
 Satu tetes campuran yang akan dianalisa
Kertas saring dibasahi dengan Kertas Saring dibentangkan diantara dua ditempatkan pada satu ujung kertas dan listrik
larutan buffer elektroda dialirkan

Setiap jenis molekul bermuatan pada campuran

akan berpindah pada jarak tertentu baik ke Kertas dipindahkan dikeringkan dan
anoda maupun ke katoda tergantung pada diwarnai dengan pewarna yang mewarnai
Bandingkan dengan standart muatan dimensi dan akan nampak sebagai titik substansinya untuk dianalisa
pada kertas dengan posisi baru
Elektroforesis Kertas
2. Elektroforesis Gel
Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang (crosslinked) yang porositasnya
dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan protein atau asam nukleat berukuran kecil
(DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida, dibuat
dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat yang memungkinkan pertautan silang
(cross-linker), menghasilkan jaringan poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk
memisahkan asam nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan
adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan.
Preparasi sampel • Campur sample DNA dengan bufer sampel yang
bertujuan untuk memudahkan sampel masuk
kedalam lubang, karena adanya gliserol yg
memperberat sampel.
• Letakkan penutup

• Hubungkan dengan power supply. Cek kabel

terhubungkan dengan benar. Jika dihidupkan,
terbentuk gelembung pada elektrode.
Terimakasih