NAMA :KAREN LEE MEI FONG

NIM :B9404211801
PPDH PERIODE 1 2021/2022 KELOMPOK C2

PPDH LAB DIAGNOSTIK

PENTING: Kirimkan jawaban anda paling lambat pukul 08.00wib tanggal 24 November
2021 ke alamat email: ni_luhma@apps.ipb.ac.id

DISKUSI TOPIK 3 – ISOLASI AGEN PENYAKIT

1. Untuk keperluan isolasi virus dari sampel organ, anda harus menyiapkan suspensi organ
10% terlebih dahulu sebelum melakukan inokulasi ke dalam TAB. Jelaskan bagaimana
cara menyiapkan suspensi organ 10% tersebut? (nilai 10)

• Langkah awal yaitu dengan memilihan organ apa yang akan di ambil/uji dan
dilakukan secara aseptis. Pada kasus ND, antara organ yang dapat digunakan adalah
otak, paru-paru, trakea dan limpa. Bagain yang diambil sebaiknya organ yang
mengalami nekorpsi atua lesi. Organ kemudian diambil sebanyak 1gr bagian, lalu
di gerus menggunakan mortar steril sampai halus. Setelah itu, tambahkan NaCl
fisiologis 0,85% atau PBS steril pH7,2 dengan perbandingan 1:9, sehingga 1 gr
organ dilarutkan dalam 9 ml NaCl fisiologis 0,85%. Kemudian dimasukkan
kedalam tabung Eppendorf dan dihomogenkan menggunakan vortex. Suspensi
kemudian disentrifus dengan kecepatan 25000 rpm selama 15 menint. akan vortex.
Supernatan kemudian dipisahkan, lalu ditambahkan antibiotik (penisilin 2.000
IU/ml dan streptomisin 2.000 g/mL). Campuran tersebut selanjutnya dimasukkan
kedalam inkubator pada suhu 37oC selama 30 menit. Suspensi organ 10% siap
untuk diinokulasikan.

2. Jelaskan tahapan kegiatan di laboratorium diagnostik bila anda diminta untuk melakukan
isolasi dan identifikasi virus ND dari kasus lapangan dengan sampel berupa organ hati,
limpa dan proventikulus asal ayam yang diduga terinfeksi virus ND dan anda disediakan
TAB umur 7 hari? (nilai 10)

1.Pembuatan Inokulum
• Kira – kira satu gram jaringan yang diambil tersebut dipotong kecil dengan gunting
atau pisau bedah. Pengerjaan inokulum harus dilakukan secara aseptic. Potongan
jaringan tersebut digerus sambil menambahkan PBS/NaCl fisiologis ke dalamnya
sedikit demi sedikit sampai konsentrasi suspense mencapai 10%-20% .
Penggerusan dilakukan sampai jaringan menjadi halus. Suspensi jaringan
kemudian dipindahkan ke dalam tabung pemusing steril (eppendorf) dan
dipusingkan dengan kecepatan 2500 rpm selama 10 – 15 menit. Pisahkan
supernatant dari endapannya. Kedalam suspensi selanjutnya diberi antibiotika
 penisilin dan streptomisin dengan dosis masing – masing 1000 – 5000 IU/ml dan
1000 – 5000 ug/ml. campuran supernatant dan antibiotika tersebut selanjutnya
dieramkan pada suhu 37oC selama 30 menit dan siap diinokulasikan.

2.Isolasi pada Telur Ayam Bertunas (TAB)

• Inokulasi dilakukan pada telur ayam bertunas (TAB) yang berusia 9 hari. Telur
ayam bertunas terlebih dahulu diamati menggunakan teropong (candling) untuk
mengetahui keadaan embrio dan batas dari daerah kantung udara. Batas kantong
udara dan embrio ditandai dengan pensil, kemudian dilakukan penusukan dengan
menggunakan alat penusuk/bor telur pada cangkang telur di daerah atas dari garis
perbatasan antara kantung udara dan daerah embrio. Disuntikan inokulum pada
lubang bekas tusukan kedalam ruang alantois menggunakan spuit 1 ml dengan dosis
0,1 ml pada setiap butir telur. Tutup lubang pada cangkang telur tersebut
menggunakan kutek dan diberikan label. Selanjutnya telur diinkubasikan pada suhu
39º C. Pengamatan dilakukan setiap hari dan pemanenan dilakukan segera setelah
kematian embrio terjadi. Pada pengujian ini, pemanenan dilakukan pada hari ke-3
pasca inokulasi.

3.Pemanenan Cairan Alantois

• Telur ayam bertunas yang akan dipanen, terlebih dahulu di teropong (candling).
Sebelum dipanen telur tersebut dimasukan kedalam lemari pendingin yang
bertujuan untuk mengurangi perdarahan saat melakukan pembukaan cangkang
telur. Pemanenan dilakukan dengan membuka cangkang telur di daerah kantong
udara dengan gunting lalu cairan alantois diambil dengan menggunakan mikropipet
dan ditampung pada tabung eppendorf. Cairan allantois yang sudah ditampung
pada tabung eppendorf kemudian disentrifuge dan supernatan diambil lalu
ditampung kembali pada tabung eppendorf yang baru kemudian disimpan untuk uji
serologi.

4.Uji Rapid Hemaglutinasi (HA)

• Uji rapid HA dilakukan dengan menambahkan 0,025 ml PBS/NaCl fisiologis pada
sumuran mikroplate, lalu ditambahkan antigen virus dan 0,5 ml suspensi sel darah
merah 1% lalu diayak selama 30 detik. Reaksi positif ditandai dengan tidak
terjadinya pengendapan pada dasar sumuran yang menunjukkan bahwa sel darah
diaglutinasi oleh antigen virus.

5.Uji Hemaglutinasi (HA) Mikrotiter

• Lubang pada plat mikro diisi masing – masing 0,025 ml PBS/NaCl fisiologis
dengan menggunakan penetes mikro/mikro pipet. Pada lubang pertama dan lubang
kedua ditambahakan suspensi antigen yang akan diuji dan selanjutnya dibuat 17
 pengenceran seri kelipatan dua mulai dari lubang kedua sampai lubang kesebelas
dengan menggunakan pengencer mikro. Ditambahkan 0,025 ml PBS/NaCl
fisiologis ke dalam tiap – tiap lubang (1-12) dan selanjutnya diaduk dengan
pengocok mikro. Pada tiap lubang masing – masing ditambahkan suspensi sel darah
merah 1% sebanyak 0,05 ml dan diayak kembali selama 30 menit. Pengamatan
hasil dilakukan pada suhu kamar tiap 15 menit selama satu jam. Titer HA virus
dinyatakan sebagai kebalikan dari pengencer tertinggi virus yang masih mampu
menimbulkan reaksi aglutinasi secara sempurna.

6. Uji Rapid Hambatan Hemaglutinasi (HI)

• Uji Rapid HI dilakukan untuk mengidentifikasi virus penyebab dari kasus yang
diperiksa. Dalam uji HI dibutuhkan serum yang mengandung antibodi spesifik
dengan antigen ND dan AI. Langkah kerja dari uji ini adalah pada lubang 1 – 4
ditambahkan 0,025 ml PBS dengan pipet mikro. Lubang pertama diisi serum positif
AI, lubang kedua diisi serum positif ND masing – masing sebanyak 0,025 ml.
Kemudian pada lubang 1, 2, dan 3 ditambahkan antigen virus 4 unit HA sebanyak
0,025 ml. Shacker selama 30 detik selanjutnya dieramkan selam 30 menit pada suhu
ruang. Selanjutnya pada lubang 1 – 4 ditambahkan suspensi sel darah merah 1%
sebanyak 0,05 ml kemudian diayak 30 detik. Selanjutnya eramkan plat mikro pada
suhu ruang sambil diamati tiap 15 menit. Lubang ke-3 merupakan kontrol positif
dan lubang ke-4 merupakan kontrol sel darah merah (PBS+sel darah merah 1%).
Pengamatan dapat dilakukan jika lubang ke-4 telah terjadi aglutinasi. Reaksi positif
pada lubang 1 dan 2 ditandai dengan adanya endapan pada lubang. Hal ini
disebabkan karena serum antibodi spesifik menghambat reaksi aglutinasi sel darah
merah oleh antigen.

3. Anda mendapatkan sampel berupa usap kloka dari ayam yang diduga terkena kasus ND.
Anda harus melakukan peneguhan diagnosa dengan melakukan isolasi dan identifikasi
virus ND. Jelaskan bagaimana anda akan melakukan isolasi dan identifikasi virus tersebut!
(nilai 10)

• Pada tahap isolasi sampel usap kloaka, dibuat suspensi dengan menambahkan NaCl
0.85% kemudian dihomogenkan menggunakan vortex.
• Setelah itu, dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 2500 rpm selama 10-15 menit.
Kemudian dilakukan pemisahan supernatan dengan endapan dan diletakkan pada
tabung eppendorf.
• Supernatan diambil 9 ml dan diletakkan di tabung eppendorf baru, lalu
ditambahkan 1 ml antibiotik yang sudah diencerkan (dengan dosis 1000-5000IU
 penicillin dan 1000-5000µg/ml streptomisin). Campuran tersebut selanjunya
disimpan pada inkubator bersuhu 37ºC selama 30 menit.
• Setelah itu, suspensi tersebut sudah dapat digunakan sebagai bahan isolasi virus.
Isolasi virus dapat dilakukan dengan menggunakan telur ayam berembrio (TAB)
umur 9-12 hari. Langkah selanjutnya TAB terlebih dahulu diamati menggunakan
teropong (candling) pada ruangan gelap untuk mengetahui keadaan embrio dan
batas dari daerah kantung udaranya. Kemudian batas kantong udara dan embrio
ditandai dengan menggunakan pensil, Setelah itu, dilakukan penghapushamaan
bagian atas cangkang telur yang berada di atas kantung udara menggunakan kapas
alkohol 70%.
• Kemudian menggunakan bor telur untuk membuat lubang kecil dibagian tersebut
tanpa merusak membrane telur. Suspensi umumnya diinokulasikan sebanyak 0.1-
0.2 ml dan setelah itu lubang tersebut ditutup menggunakan kuteks transparan.
Tidak lupa untuk memberi label pada telur yang berisi inokulum dan waktu
inokulasi.
• Telur diinkubasikan di inkubator bersuhu 37ºC-38ºC selama 4 hari dan diamati
setiap hari (pagi dan sore) dengan cara di candling dan pemanenan dilakukan segera
setelah kematian embrio terjadi. Pada hari keempat telur yang masih hidup
dimasukan kedalam refrigator selama 24 jam untuk mematikan embrionya.
• Pada hari ke 5 semua telur dapat diamati dan diisolasi / dipanen virusnya dari cairan
alantoisnya dan untuk dilakukan identifikasi. Virus pada TAB dipanen dengan cara
bagian atas telur (tempat kantung udara atau bekas inokulasi) dihapushama
menggunakan alkohol 70%, kemudian potong cangkang telur secara melingkar lalu
selaput korioalantois dibuka menggunakan tissue forceps dengan hati-hati. Cairan
alantois diaspirasi menggunakan syringe/pipet dan dimasukkan ke dalam tabung
eppendorf steril. Cairan allantois yang sudah ditampung pada tabung eppendorf
kemudian di sentrifuse dan supernatan diambil lalu ditampung kembali pada tabung
eppendorf yang baru kemudian disimpan dalam refrigetator apabila tidak langsung
diuji.
• Kemudian identifikasi dengan uji hemaglutinasi cepat (rapid test), haemaglutinasi
(HA) dan/atau haemaglutinasi inhibisi (HI).

4. Menurut pendapat anda mengapa untuk menumbuhkan virus ND pada telur ayam
berembrio rute yang digunakan adalah alantois sedangkan menumbuhkan virus IBD anda
melakukan inokulasi ke membran korio alantois? (10 poin)

• Virus tetelo ( Newcastle Disease) merupakan virus hidup yang sel targetnya adalah
sel epitel mukosa saluran pernafasan atau pencernaan sehingga dipilih ruang
alantois sebagai tempat inokulasinya karena pada ruangan tersebut terdapat banyal
sel epitel khorion dan alantois yang bisa menjadi sel target dari virus ND. Manakala
virus IBD inokulasi di membrane korio allantois karena membran korio alantois
 penuh akan pembuluh darah cocok sebagai virus IBD yang bersirkulasi dalam darah
sebelum ke organ target berupa busa fabricius untuk bereplikasi.

5. Diduga menderita ND, sampel organ berupa otak memberikan hasil yang positif
berdasarkan hasil uji material genetik dengan PCR tetapi hasil isolasi virus pada TAB tidak
ada virus yang tumbuh. Apa penjelasan yang dapat anda berikan berdasarkan hasil uji
laboratorium yang sudah dilakukan? (10 poin)
• Uji PCR (Polymerase Chain Reaction) dapat mendeteksi material genetik dengan
tingkat sensitivitas yang tinggi dan cepat. Sementara itu, TAB hanya sebagai media
virus untuk melakukan replikasi, dan juga tingkat ke akuratan uji PCR sangatlah
tinggi jika dibandingkan dengan uji TAB, dimana pada uji TAB sendiri rentan
terjadi kesalahan-kesalahan selama proses pengujian terkhusus pada tahap isolasi
dan identifikasi.

DISKUSI TOPIK 4 – IDENTIFIKASI AGEN PENYAKIT

6. Hasil titrasi virus ND yang anda peroleh adalah 2560 HAU /ml. Jelaskan bagaimana anda
akan menyiapkan virus standar 4 HAU untuk mikrotitrasi HI? (10 poin)

2560 HAU x 0.025ml = 64HAU

1ml 0.025ml
Kemudian diencerkan menjadi 4HAU
64 4 1ml titer virus

0 60 15ml akuades
Sehingga untuk menyiapkan virus standar dibutuhkan 1 ml titer virus dan 15ml aquades

7. Anda memerlukan virus ND standar untuk melakukan uji Hambatan Hemaglutinasi metode
beta dengan mikrotitrasi untuk 50 sampel. Apabila anda memiliki virus ND 0.16 × 1010
virus partikel per ml sebanyak 20 ml di laboratorium anda, jelaskan bagaimana cara anda
menyiapkan virus standar yang anda butuhkan! (10 poin)

1 HAU = 106 partikel dan virus ND Standar uji HI = 4 HAU

Jika terdapat 0.16 x 1010 virus partikel, maka :

= 1600 x 106 partikel
= 1600 HAU

1600 4 1 bagian virus

4
0 1596 399 bagian pengencer
 Mikrotitrasi 50 sampel (setiap sampel diperlukan 12 sumur dan volume setiap sumur
25µl
Total sumur = 50x12
= 600 sumur
Total volume = 600x25µl
= 15000µl
= 15 ml

Jadi :
1
Virus yang diperlukan yaitu 400x15ml = 0.0375 ml
= 37,5 µl
399
Pelarut yang diperlukan yaitu 400x15ml = 14.9625 ml
= 14962.5 µl

8. Sebelum menumbuhkan virus ND dengan menggunakan telur ayam berembrio, titer virus
ND yang anda miliki adalah 256 HAU/25 mikroliter. Pada hari ke-4 setelah inokulasi anda
memperoleh virus ND dengan titer 256 HAU/25 mikroliter. Menurut pendapat anda apa
yang terjadi? Apakah virus ND yang ingin anda tumbuhkan dan perbanyak dalam TAB
tidak tumbuh? Ataukah ada penjelasan lainnya? Jelaskan pendapat anda! (10 poin)

• Jumlah titer virus yang tidak bertambah bisa diakibatkan oleh volume suspensi
virus yang diinokulasikan kedalam telur terlalu kecil sehingga replikasi virus di
dalam TAB tidak maksimal. Jika virus tidak tumbuh maka kemungkinan jumlah
titer virus yang dipanen lebih sedikit atau bahkan tidak ada sama sekali karena
embrio ayam tidak akan mati. Kemungkinan yang dapat terjadi juga jarak waktu
antara penyiapan suspensi virus hingga inokulasi selanjutnya terlalu lama, maupun
penyimpanan suspensi virus yang dalam suhu kamar dapat menurunkan
kemampuan virus untuk tumbuh dalam TAB yang digunakan. Faktor lain yang
dapat mempengaruhi inokulasi virus diembrio diantaranya adalah rute inokulasi,
strain virus, titer virus, TAB yang digunakan bukan dari ayam Specific Pathogen
Free (SPF) dan tahapan perkembangan embrio dimana umur TAB sudah terlalu tua
atau karena kesalahan-kesalahan selama melakukan uji.

9. Hasil uji HI antiserum ND dengan mikrotitrasi menunjukan penghambatan aglutinasi pada

sumur ke-9. Apa yang dapat anda jelaskan dari hasil tersebut? Uraikan pendapat anda
dengan jelas! (10 poin)
• Hambatan aglutinasi terjadi sampai sumur ke 9 (29 ). Hasil uji HI dikatakan positif
bila terjadi hambatan aglutinasi yang nampak dengan adanya pengendapan eritrosit
pada sumuran plate seperti pada kontrol eritrosit. Adanya titer antibodi 29 yang
terukur kemungkinan karena ayam tersebut terinfeksi oleh virus ND namun
sebelumnya telah memiliki antibody ND tersebut. Pembentukan antibody dan
mulai tampak dalam serum memerlukan waktu 6-10 hari dan mencapai puncaknya
3-4 minggu, sedangkan antibody mengalami penurunan setelah kira-kira 3-4 bulan
dan sudah tidak terdeteksi setelah 8-12 bulan. Penghambatan aglutinasi terjadi
 artinya antigen homolog dengan antibody sehingga hemaglutinin pada antigen
tidak dapat berikatan dengan sel darah merah dan terjadi endapan

10. Peneguhan diagnosa di laboratorium terdiri atas 2 tahapan yaitu isolasi agen penyakit dan
identifikasi agen penyakit. Jelaskan beberapa cara atau metode yang anda ketahui untuk
melakukan isolasi agen penyakit terutama virus! Untuk identifikasi agen penyakit (virus),
uji apa saja yang dapat anda gunakan? (10 poin)

Terdapat beberapa cara atau metode untuk melakukan isolasi agen penyakit terutama virus
yaitu:
Invitro
• Jaringan, sel, sekresi atau ekskresi yang diduga terdapat virus diisolasi pada sel
kultur yang sesuai dengan lokasi virus didapatkan.
Invivo
• Jaringan, sel, sekresi atau ekskresi yang diduga terdapat virus diisolasi di dalam
tubuh hewan yang kemudian perkembangannya diamati dengan melihat adanya
sakit atau kematian. Contohnya yaitu: Isolasi langsung dari inang asli, isolasi dari
hewan coba atau isolasi dari Telur Ayam Berembrio (TAB).

Tahap selanjutnya setelah isolasi adalah identifikasi agen penyakit (virus), uji yang dapat
digunakan dalam identifikasi adalah:
ELISA
• Adalah salah satu uji serologis yang dapat digunakan untuk mengukur
antigen/antibodi. Prinsip utama teknik ELISA adalah penggunaan indikator enzim
untuk reaksi imunologi.
Immunochromatografi
• Adalah uji yang digunakan untuk mendeteksi molekul secara cepat salah satu
contohnya adalah penggunaan rapid tes pada kasus Covid-19
PCR
• Merupakan proses sintesis enzimatik untuk mengaplifikasi nukleotida yang
difokuskan pada DNA target.
Quantitative polymerase chain reaction (qPCR)
• Merupakan suatu metode biologi molekuler berbasis reaksi rantai polimerase.
Metode ini mendeteksi amplifikasi gen target selama PCR berlangsung.
Reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
• Dilakukan dengan terlebih dahulu mengubah (me-reverse) RNA virus menjadi
DNA virus.
Uji HA dan HI
• Berfungsi untuk mengetahui titer virus yaitu kemampuan virus dalam menginfeksi
yang ditandai dengan adanya hemaglutinasi eritrosit.

-----------------------------------------------AKHIR PERTANYAAN----------------------------------------------------------------