MAKALAH TUGAS AKHIR

LABORATORIUM DIAGNOSTIK

Deteksi virus ND menggunakan Uji HA cepat, Uji HA makrotitrasi, Uji HA

mikrotitrasi dan HI mikrotitraasi

PPDH PERIODE I TAHUN 2021/2022

KELOMPOK C2

Dhelia Anggraeni, SKH B9404211034

Di bawah bimbingan:
Dr. drh. Ni Luh Putu Ika Mayasari

LABORATORIUM DIAGNOSTIK
PENDIDIKAN PROFESI KEDOKTERAN HEWAN
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
IPB UNIVERSITY
BOGOR
2021
 PENDAHULUAN
Latar belakang
Newcastle Disease (ND) merupakan salah satu penyakit infeksius yang
penting dalam industri perunggasan. Sejak tahun 1926, ND dilaporkan sebagai
penyakit endemis yang terjadi di beberapa negara di dunia. Penyakit ini
menyebabkan kerugian yang sangat signifikan terhadap perekonomian
perunggasan. Hal ini dikarenakan angka kesakitan dan angka kematian yang
tinggi sampai 100% dari peternakan unggas yang terinfeksi virus ND strain
virulen sehingga ekspor produk unggas terhambat. Peternakan unggas yang
terserang virus ND strain avirulent juga berpengaruh terhadap penurunan
produksi unggas (Leuck et al. 2004).
Beberapa metode uji dapat dilakukan untuk mendeteksi keberadaan virus
ND, diantaranya yaitu uji HA dan HI. Uji HA merupakan uji yang digunakan
untuk mendeteksi virus yang memiliki protein hemaglutinin. Hemaglutinin ini
dapat mengaglutinasi eritrosit beberapa spesies hewan, salah satunya eritrosit
unggas. Uji HA juga dapat digunakan sebagai dasar untuk menentukan titer virus
BD (Darminto 1996). Uji HA untuk menentukan titer virus ND didasarkan pada
prinsip kemampuan hemaglutinasi dari virus ND terhadap sel darah merah
(Grimes 2002). Uji HA cepat digunakan untuk mendeteksi apakah terdapat virus
ND atau tidak. Sedangkan uji HA makrotitrasi atau mikrotitrasi digunakan untuk
mengetahui titer virus. Kemampuan virus dalam menginfeksi ditandai dengan
adanya hemaglutinasi eritrosit. Titer virus dapat diketahui dengan melihat
sumuran terakhir pada nomor tertinggi (end point) yang menunjukkan adanya
hemaglutinasi sempurna. Hal itu ditandai dengan adanya agragat-agregat di dasar
sumur (Stephen 1980).
Uji hemaglutination inhibition (HI) merupakan uji yang berfungsi untuk
mengetahui adanya respon antibodi terhadap antigen virus patogen pada hewan
dan mengetahui adanya korelasi antara titer antibodi dan ketahanan pada uji
tantang dengan virus patogen. Adapun beberapa faktor yang mempengaruhi hasil
uji HA yaitu kesesuaian subtype virus yang digunakan, faktor penyimpanan, dan
prosedur kerja yang sesuai dengan SOP yang telah ditetapkan juga akan
berpengaruh terhadap uji HI maupun uji HA (Heryanto 2010).

Tujuan
Pengujian ini bertujuan untuk mendeteksi dan mengukur jumlah titer virus
Newcastel Disease (ND) dengan menggunakan uji HA dan uji HI.
 METODE
Waktu dan Tempat
Pengujian ini dilakukan pada tanggal 25 sampai dengan 29 November
2021 di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Hewan Institut
Pertanian Bogor.

Prosedur Pengujian
1. Uji HA Cepat
Alat dan Bahan:
Alat yang digunakan dalam uji aglutinasi cepat yaitu pipet pasteur, gelas
objek, dan tusuk gigi. Sedangkan bahan yang digunakan dalam pengujian ini
yaitu suspensi virus ND, suspensi sel darah merah ayam 5%, dan Nacl fisiologis
(0.85%).
Prosedur :
Prosedur pengujian aglutinasi cepat diawali dengan menyiapkan gelas
objek yang bersih dan bebas lemak kemudian teteskan (dua) suspensi sel darah
merah 5% di kedua ujung gelas objek. Setelah itu, ditambahkan dua tetes NaCl
fisiologis pada satu ujung dan dua tetes suspensi virus yang dipanen pada ujung
lain. Kemudian campuran tersebut diaduk dengan tusuk gigi yang berbeda,
biarkan sesaat dan amati apakah terjadi aglutinasi/tidak. Sebagai kontrol negatif
adalah bagian yang ditetesi NaCl dimana suspensi sel darah merah tidak
teraglutinasi. Dan sebaliknya yang ditetesi virus, sel darah merah akan
teraglutinasi.

2. Uji HA Makrotitrasi
Alat dan Bahan:
Alat yang digunakan dalam uji HA makrotitrasi yaitu tabung reaksi
sebanyak 10 tabung, pipet 1 mL, pipet 5 mL, dan rak tabung reaksi. Sedangkan
bahan yang digunakan dalam pengujian ini yaitu suspensi virus ND, suspensi sel
darah merah ayam 1%, dan NaCl fisiologis (0.85%).
Prosedur:
Sebanyak 10 tabung reaksi ditempatkan pada rak tabung reaksi.
Kemudian menggunakan pipet 5 mL masukkan 0,8 ml NaCl fisiologis pada
tabung pertama dan 0,5 ml pada tabung ke-2 sampai 10. Setelah itu ambil 0,2 mL
suspensi virus menggunakan pipet 1 mL dan masukkan kedalam tabung pertama.
Lakukan pencampuran suspensi virus dengan NaCl pada tabung pertama dengan
cara menghisap dan meniup cairan tersebut, lakukan cara ini paling tidak lima
kali. Ambil 0,5 mL dari tabung pertama kemudian pindahkan ketabung kedua
dan lakukan pencampuran seperti tabung pertama. Selanjutnya pindahkan 0,5
mL ke tabung 3, begitu seterusnya sampai tabung ke 10. Dari tabung ke-10
diambil 0,5 mL dan dibuang, yakni bersama pipet tempatkan di ember
dekontaminasi. Tabung ke 12 sebagai kontrol negatif jadi hanya berisi NaCl
fisiologis 0,5 mL saja. Kemudian tambahkan 0,5 mL NaCl fisiologis ke dalam
seluruh tabung. Setelah itu Tambahkan 0,5 ml suspensi sel darah merah 1 % ke
dalam seluruh tabung menggunakan pipet 5 ml yang baru, penambahan suspensi
RBC 1% dilakukan dari tabung ke 12 dan berakhir di tabung 1. Kocok tabung
dengan menggoyang-goyangkan rak kemudian diinkubasikan pada suhu ruang
selama kurang lebih 30 menit,atau saat tabung kontrol negatif (tab 12) telah
mengendap, kemudian dibaca hasilnya.
Tabel 1. Diagram HA test makrotitrasi

3. Uji HA Mikrotitrasi
Alat dan Bahan:
Alat yang digunakan dalam pengujian ini meliputi mikroplate u bottom,
mikrotip, dan mikropipet. Sedangkan bahan yang dibutuhkan pada pengujian ini
adalah suspensi virus, NaCl fisiologis (0.85%), serta suspensi sel darah merah
1%.
Prosedur:
 Sumur - sumur (1–12) mikroplate U bottom diisi dengan NaCl fis.
Masing-masing 25 l dengan mikropipet 200 l. Ambil 25 l suspensi virus dan
masukkan kedalam sumur pertama lakukan pencampuran suspensi virus dengan
NaCl pada sumur pertama dengan cara mengambil dan mengeluarkan cairan
tersebut dengan mikropipet, lakukan cara ini paling tidak lima kali. Ambil 25  l
dari sumur pertama kemudian pindahkan kesumur kedua dan lakukan
pencampuran seperti diatas, selanjutnya pindahkan 25 l ke lubang ke- 3, begitu
seterusnya sampai sumur ke 11. Dari sumur ke- 11 diambil 25 l dan dibuang.
Tambahkan 25 l NaCl fis ke dalam seluruh sumur. Tambahkan 25 l suspensi
sel darah merah 1% ke dalam seluruh sumur. Kocok mikroplate dengan
menggoyang-goyangkan kemudian diinkubasikan pada suhu ruang selama
kurang lebih 30 menit, kemudian dibaca hasilnya.

Tabel 2. Diagram HA test mikrotitrasi

4. Uji HI Mikrotitrasi
Alat dan Bahan:
Alat yang digunakan dalam pengujian ini meliputi mikroplate u bottom,
mikrotip, dan mikropipet. Sedangkan bahan yang dibutuhkan pada pengujian ini
adalah suspensi virus ND standar 4 HAU/0.025 mL, NaCl fisiologis (0.85%),
serum anti ND, serta suspensi sel darah merah 1%.
Prosedur:
 Sumur 1–12 dari mikroplate U bottom diisi dengan NaCl fis. steril
masing-masing 25 l dengan mikropipet kapasitas 200 l . Ambil 25 l serum
yang akan diuji dan masukkan kedalam sumur pertama lakukan pencampuran
serum dengan NaCL fis.pada sumur pertama dengan cara mengambil dan
mengeluarkan cairan tersebut dengan mikropipet, lakukan cara ini paling tidak
lima kali (jangan sampai berbuih). Ambil 25 l dari sumur pertama kemudian
pindahkan ke sumur kedua dan lakukan pencampuran tersebut diatas, selanjutnya
pindahkan 25 l ke sumur ke- 3, begitu seterusnya sampai sumur ke 12. Dari
sumur ke- 12 diambil 25 l dan dibuang. Tambahkan suspensi virus standar (4
HAU) masing-masing 25 l pada sumur 1 – 12 Kocok mikroplate dengan
menggoyang-goyangkannya kemudian diinkubasikan pada suhu ruang selama 30
menit. Tambahkan 25 l suspensi sel darah merah 1 % ke dalam seluruh sumur.
Kocok mikroplate dengan menggoyang-goyangkannya kemudian diinkubasikan
pada suhu ruang selama kurang lebih 40 menit, kemudian dibaca hasilnya.

Tabel 3. Diagram HI test mikrotitrasi

5. Inokulasi virus ND pada telur

Alat dan Bahan:
 Alat yang digunakan dalam pengujian ini yaitu syringe 1 mL, bor telur,
alat candling, dan selotip. Sedangkan bahan yang digunakan dalma penelitian ini
yaitu telur embrio tertunas umur 9-12 hari, suspensi virus, antibiotik penisilin
dan streptomisin, serta kapas dan alkohol.
Prosedur:
Lakukan candling pada telur yang akan digunakan. Tentukan batas
kantung udara dan letak kepala embrio. Beri 2 tanda menggunakan pensil, satu
pada bagian atas kepala embrio dan sebuah diatas kantung udara. Hapus
hamakan daerah yang diberi tanda tersebut dengan mengoleskan alkohol 70%.
Buat lubang pada bagian kulit telur menggunakan bor telur tetapi jangan sampai
merusak “shell membrane” di dua tempat yang diberi tanda. Inokulasikan 0,2 ml.
suspensi virus (inokulum) kedalam ruang alantois, orientasinya melewati batas
kantung udara melalui lubang di atas kepala embrio. Tutup kembali lubang
tempat penyuntikan dengan kolodion atau bahan penutup lainnya. Setelah itu
letakkan di dalam inkubator 37℃-38℃dan amati tiap hari (dengan dicandling)
sampai hari ke empat. Telur yang mati 24 jam setelah inokulasi disingkirkan
karena kematian biasanya bukan oleh virus tetapi adanya kontaminasi organisme
lain. Telur yang mati pada 2-4 hari setelah inokulasi disimpan dalam refrigator
(lemari pendingin), sedangkan telur yang tidak mati diamati sampai hari keempat
post inokulasikan. Pada hari keempat telur yang masih hidup dimasukan kedalam
refrigator selama 24 jam untuk mematikan embrionya. Telur-telur ini akan
digunakan untuk praktikum berikutnya. Dari telur ini dapat diamati dan
diisolasi / dipanen virusnya dari cairan alantois untuk dilakukan identifikasi.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Uji Aglutinasi Cepat

Uji Hemaglutinasi (HA), ada 2 jenis, yaitu uji HA cepat dan lambat. Uji HA
cepat dilakukan dengan mencampur masing-masing 2 tets suspensi virus dengan
media 5% Sel Darah Merah (SDM) ayam. Hasil positif ditunjukkan adanya
aglutinasi sel darah merah.
 Gambar 1 Hasil uji swab menunjukkan sel darah merah teraglutinasi (+)
Berdasarkan dari hasil uji HA cepat, diketahui bahwa hasil uji swab tersebut
positif terdapat virus. Hal ini terbukti dengan terbentuknya aglutinasi sel darah
merah pada gelas objek. Salah satu sifat yang dapat digunakan untuk
mengidentifiksi virus adalah kemampuan mengaglutinasi sel darah merah. Virus
yang dapat mengaglutinasi sel darah merah salah satunya adalah virus ND. Virus
dapat mengaglutinasi darah (eritrosit) karena virus mempunyai protein
haemaglutinin pada permukaan virusnya. Haemaglutinin secara spontan akan
melekat pada permukaan sel darah merah yang merupakan receptor dari
membran eritrosit, sehingga membentuk sebuah jembatan antara dua sel darah
merah.

Uji HA Makrotitrasi
Uji HA makrotitatrasi bertujuan untuk mengetahui titer HA virus.
Gambar 2 Hasil uji HA makrotitrasi. Tabung 1 sebagai kontrol positif dan tabung
12 sebagai kontrol negatif

Pembacaan hasil uji HA makrotitrasi dapat dilakukan apabila eritrosit pada

tabung kontrol telah mengendap ke dasar tabung. Tabung nomor 12 tidak terjadi
aglutinasi. Hasil dikatakan positif bila terjadi aglutinasi yang komplit dari sel
darah merah, yang terlihat bentuk kasar seperti pasir pada pinggir dasar tabung.
Batas nilai dari titrasi adalah pengenceran tertinggi dari antigen yang masih
menghasilkan aglutinasi komplit.
Berdasarkan hasil uji HA makrotitrasi diketahui bahwa aglutinasi terakhir terjadi
pada tabung ke 8. Tabung ke-8 tersebut memiliki titer virus sebesar 640
HAU/0.5 mL, dimana 1 HAU setara dengan 107 partikel virus.
Uji HA Mikrotitrasi
Hasil uji HA mikrotitrasi
Berdasarkan hasil uji HA mikrotitrasi, diketahui bahwa aglutinasi terakhir terjadi
pada tabung ke-9. Tabung ke-9 tersebut memiliki titer virus sebesar 512
HAU/25µL.

Uji HI Mikrotitrasi

Gambar Pembacaan hasil uji HI

Uji RBT dan Pullorum

Gambar Hasil uji pullorum menunjukkan positif

Gambar Hasil uji RBT menunjukkan hasil negatif

SIMPULAN

DAFTAR PUSTAKA