ELISA ( Enzym-Linked Immunosorbent Assay)

IDENTIFIKASI PROTEIN HEWANI PADA PRODUK BUMBU INSTAN DENGAN

MENGGUNAKAN METODE ELISA ( Enzym-Linked Immunosorbent Assay)

NURAINUN DARWIS
  Enzym-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu
teknik biokimia yang terutama digunakan dalam bidang
imunologi untuk mendeteksi kehadiran :
 Antibodi
Definisi  Protein
 Peptida
 Biomolekul
 1. Antigen/sampel ditambahkan ke plate
2. Blocking buffer ditambahkan untuk menghalangi tempat
pengikatan protein

Prinsip kerja 3. Tambahkan antibodi primer yang sesuai

ELISA 4. Tambahkan konjugat antibodi sekunder-enzim yang sesuai

yang mengenali dan berikatan dengan antibodi primer
5. Tambahkan Substrat TMB(tetrametylbenzidine) yang akan
dikonversi oleh enzim menjadi bentuk yang terdeteksi
  Antibodi (antiserum) yaitu protein yang diproduksi oleh sistem
Komponen imun tubuh untuk melawan antigen

penting dalam  Antigen yaitu molekul yang merangsang tubuh untuk

memproduksi antibodi ketika masuk ke tubuh sebagai benda
Imunoassay asing misal : virus, bakteri,dll
 1. Kit ELISA
2. Polysteren 96 well microtiter plate (microplate)
3. Micropipet (100-200uL)
4. Microplate shaker
5. ELISA reader
Komponen kit 6. Conjugated detection antibody
7. Microplate washer
8. Baker glass
9. Substrate
10. Stop solution
  1.Timbang sampel sebanyak 25 gram kemudian tambahkan 100
ml aquades atau larutan garam 0,9% homogenisasi sampel
seama 15 menit dan didiamkan selama 10-15 menit.
 2. Aduk kembali sampel selama 15 menit dan didiamkan lagi
Preparasi selama 10-15 menit sampai terbentuk fasa cair dan endapan.
sampel  3. Saring fasa cair dari sampel menggunakan kertas whatman
no.4 (untuk mendapatkan ekstrak yang lebih baik dapat
dilakukan proses sentrifugasi sebelum disaring) sampai
didapatkan ekstrak sampel.
  Setelah dilakukan preparasi pada sampel, maka dilakukan pengujian sampel
sebagai berikut :
1. Pipet 100 μL ekstrak sampel atau control positif pada wells uji
2. Inkubasi pada suhu ruang selama 45 menit
3. Cuci wells uji dengan cairan pencuci sebanyak 3 kali
4. Tambahkan 50 μL species biotin pada wells uji
5. Inkubasi pada suhu ruang selama 45 menit
6. Cuci wells uji dengan cairan pencuci sebanyak 3 kali.

Pengujian 7. Tambahkan 50 μL larutan konjugat (Avidin Peroxidase Conjugate) ke

dalam wells uji

sampel 8. Inkubasi pada suhu ruang selama 15 menit

9. Cuci wells uji dengan cairan pencuci sebanyak 5 kali
10. Tambahkan 100 μL TMB substrat pada wells uji 11. Inkubasi pada suhu
ruang selama 45 menit tanpa pengocokan
12. Tambahkan 50 μL stop solution pada wells uji 13. Campur selama 10
detik untuk menghentikan perubahan warna dan meratakan stop solution.
Perubahan warna terjadi dari biru ke kuning
14. Ukur absorbansinya menggunakan ELISA reader pada λ 450 nm. Kontrol
negative menggunakan aquades.
 1. Direct ELISA
2. Indirect ELISA
3. Sandwich ELISA
4. ELISA kompetitif : antihuman terikat pada plate, deteksi ab
Tipe ELISA Pengelompokkan tersebut didasarkan pada kompetisi atau inhibisi
dari ELISA. Direct ELISA adalah salah satu jenis ELISA yang
paling sederhana dalam reaksinya. Jenis ELISA ini hanya
membutuhkan antigen, antibodi, enzim dan substrat .
 1. Inkubasi dengan sampel uji 100ul sampel uji atau standar
dalam buffer ditambahkan ke tiap well. Tutup plate dan
inkubasi pada suhu ruang selama 2 jam.
2. Cuci
3. Lapisi well dengan antibodi 100ul antibodi yang terlarut

Tahapan
dalam buffer ditambahkan ke tiap well. Tutup plate dan
inkubasi pada 4 derajat
ELISA 4. Cuci
5. Inkubasi dengan Enzim-antibodi terkonjugasi 100ul enzim-
antibodi terkonjugasi dalam buffer ditambahkan ke tiap Well.
Tutup plate dan inkubasi pada suhu ruang selama 1 jam.
Enzim antibodi terkonjugasi seharusnya melawan antigen agar
dapat ditunjukkan.
6. Cuci
7. Pembentukan warna 100ul substrat kromogenik ditambahkan pada
tiap well. Tutup plate dan inkubasi 15 menit, hingga terbentuk warna
yang sesuai.
8. Penghentian pembentuksn warna. Penghentian reaksi menambahkan
100ul pada 0,5M H2SO4 pada tiap well

9. Membaca hasil. Baca hasil langsung melalui bag. Bawah plate

menggunakan fotometer elisa reader otomatis atau semiotomatis.
Panjang gel. Yang direkomendasikan antara 620-650nm.
  Yaitu saat cahaya dengan panjang gel. Tertentu disinarkan pada.
Fluoresensi Suatu sampel, komplex Ag/Ab Akan berfluoresensi sehingga
jumlah antigen pada sampel dapat disimpulkan berdasarkan
dalam ELISA besarnya fluoresensi dengan menggunakan spektrofotometer.
 Penelitian ini dilakukan untuk pemantauan produk yang beredar
saat ini yang mengindikasikan tidak sesuai dengan label produk.
Sampel yang dianalisis untuk diidentifikasi berjumlah 6 produk
bumbu instan impor. Pengujian dengan menggunakan metode
ELISA dapat diperoleh data berupa kualitas dan semi kuantitas.
Hasil pengujian menunjukkan bahwa dihasilkan sampel A
positif mengandung sapi tetapi negative dari kandungan babi,
unggas, dan kambing. Pada sampel B, C, D, E dan F diperoleh
hasil yang negatif dari kandungan sapi, babi, unggas, dan
kambing.
HASIL
  Reagen, waktu simpan laMa

Keuntungan  Spesifitas dan sensitivitas ELISA tinggi

ELISA  Mudah dilihat hasilnya dan prosedur cepat

 ELISA dapat digunakan untuk berbagai infeksi
  Pengukuran aktivitas enzim jauh lebih komplex dibandingkan
pengukuran aktivitas dengan radiostop
 Aktivitas enzim terpengaruh oleh konstituen plasma
 Kit tersedia secara komersial dan tidak murah
Kekurangan  Sangat spesifik utk antigen tertentu dan tidak akan mengenali
ELISA antigen lain.
 Bisa terjadi positif atau negatif palsu, terutama dengan antigen
yang termutasi.