1. Direct ELISA, biasanya digunakan dengan kompetisi dan Inhibisi ELISA.

Digunakan untuk deteksi antigen.

2. Indirect ELISA, antigen terikat pada plate. Digunakan untuk deteksi antibody.

3. Sandwich ELISA, antibodi terikat pada Plate. Digunakan untuk deteksi

antigen.

4. Capture ELISA, antihuman antibodi terikat pada Plate. Digunakan untuk

deteksi antibody.

ELISA dapat mengevaluasi kehadiran antigen dan antibodi dalam suatu sampel, karenanya
merupakan metode yang sangat berguna untuk mendeterminasi konsentrasi antibodi dalam
serum (seperti dalam tes HIV), dan juga untuk mendeteksi kehadiran antigen. Metode ini juga bisa
diaplikasikan dalam industri makanan untuk mendeteksi allergen potensial dalam makanan seperti
susu, kacang, walnut, almond, dan telur. ELISA juga dapat digunakan dalam bidang toksikologi
untuk uji pendugaan cepat pada berbagai kelas obat.
ELISA adalah tes skrining dahulu banyak digunakan untuk HIV karena kepekaan tinggi. Dalam
ELISA, serum seseorang diencerkan 400 kali lipat dan diterapkan pada pelat yang antigen HIV
yang terpasang. Jika antibodi terhadap HIV hadir dalam serum, mereka dapat mengikat antigen
HIV. Pelat ini kemudian dicuci untuk menghapus semua komponen lain dari serum. Sebuah
"antibodi sekunder" khusus disiapkan - antibodi yang mengikat antibodi lain - kemudian diterapkan
ke piring, mencuci diikuti oleh yang lain. Ini antibodi sekunder secara kimiawi terkait di muka untuk
enzim.
"Anti IgG manusia" Antibodi Ganda Sandwich ELISA
Dengan demikian, piring akan berisi enzim sebanding dengan jumlah antibodi sekunder terikat ke
piring. Sebuah substrat untuk enzim diterapkan, dan katalisis oleh enzim mengarah ke perubahan
pada warna atau fluoresensi. Hasil ELISA dilaporkan sebagai nomor; aspek paling kontroversial dari
tes ini adalah menentukan "cut-off" titik antara positif dan hasil negatif. Sebuah titik cut-off dapat
ditentukan dengan membandingkannya dengan standar yang dikenal. Jika tes ELISA digunakan
untuk skrining obat di tempat kerja, konsentrasi cut-off, 50 ng / mL, misalnya, didirikan, dan sampel
yang berisi konsentrasi analit standar akan disiapkan. Diketahui bahwa menghasilkan sinyal yang
lebih kuat daripada sampel dikenal adalah "positif." Mereka yang menghasilkan sinyal lemah, yang
"negatif." Dokter Dennis E Bidwell dan Alister Voller menciptakan tes.
Kegunaan lain dari ELISA meliputi:
1. deteksi antibodi mikobakteri dalam TB.
2. deteksi rotavirus dalam tinja.
3. deteksi penanda hepatitis B dalam serum.
4. deteksi enterotoksin E. coli dalam tinja.

Prinsip :
mereaksikan antibodi dan antigen secara spesifik, perbedaannya ada pada substrat ( zat yang
digunakan untuk mendeteksi suatu hasil reaksi ) yang digunakan. Pada ELISA, hasil reaksi akan
memunculkan warna yang bisa diukur dengan alat yang disebut Colorimetri. Pada Fluorescence, hasil
reaksi berupa pendaran cahaya yang terbaca oleh fluoresensi, sedangkan pada Chemiluminescence
hasil reaksi berupa pendaran kimiawi yang terbaca oleh Chemiluminescent.

Beberapa bahan yang digunakan dalam teknik ELISA, yaitu :

1. Bahan padat yang dipakai dalam ELISA termasuk selulosa, dextran berangkai silang,
poliacrilamide, polistiren dan polipropilen. Bentuknya dapat berupa butiran, lempeng atau
tabung.

2. Antigen dapat dilekatkan secara adsorpsi pasif atau diikat secara kovalen dengan sianoben-
bromida.

3. Enzim dipilih yang aktivitasnya tinggi misalnya fosfatse alkalis dan peroksidase. Bahan
pengabung yang sering dipakai adalah glutaraldehide.

4. Substrat paling baik jika stabil, aman dan murah. Substrat tidak berwarna yang menjadi
berwarna karena perubahan oleh enzim. Misalnya : p-nitrofenilfosfat berubah menjadi p-
nitrofenol berwarna kuning oleh enzim fosfatase alkalis. Substrat lain, misalnya diamino
benzidine,5-aminosalisilat, O-fenilen-diamin dipakai untuk enzim peroksidase.

Material dalam metode ELISA

AntigenM

onoclonal Ab

Microplate

Blocking Buffer

Serum sample

Conjugate (secondary Ab + Enzyme)

Subtrate

Stop Sol.

Alat yang digunakan dalam metode ELISA

96-Wells Microplate

Micropipettes

Multichannel pipette

Elisa test kit

Prinsip :
mereaksikan antibodi dan antigen secara spesifik, perbedaannya ada pada substrat ( zat yang
digunakan untuk mendeteksi suatu hasil reaksi ) yang digunakan. Pada ELISA, hasil reaksi akan
memunculkan warna yang bisa diukur dengan alat yang disebut Colorimetri. Pada Fluorescence, hasil
reaksi berupa pendaran cahaya yang terbaca oleh fluoresensi, sedangkan pada Chemiluminescence
hasil reaksi berupa pendaran kimiawi yang terbaca oleh Chemiluminescent.
Prosedur Capture Elisa
1. kedua antibodi dimurnikan dan salah satu diberi label.
2. Plate microtiter yang paling baik untuk assay ini adalah terbuat dari polyvinylchloride (PVC).
3. Tempelkan antibodi yang tidak berlabel pada dasar masing-masing plate. Dengan memasukkan
sekitar 50 L larutan antibodi ke masing-masing well. PVC akan mengikat sekitar 100ng/well (300
ng/cm2). Banyaknya antibodi yang digunakan sangat bergantung pada masing-masing assay, namun
jika dikehendaki pengikatan yang maksimal gunakan paling tidak sebanyak 1 g/well. Jumlah ini di
atas kapasitas well, namun akan memberikan pengikatan yang lebih cepat.
4. Inkubasi microtiter plate semalam pada temperatur 4C untuk mendapatkan penempelan atau
pengikatan yang sempurna.
5. Cuci wells sebanyak dua kali menggunakan PBS. Pisahkan larutan pencuci, dengan memipet atau
suksion.
6. Yang tersisa adalah protein antibodi yang terikat pada microtiter plate dan dijenuhkan dengan
bufer. Tambahkan masing-masing well sampai penuh dengan 3% BSA/PBS dan 0,02% natrium azida.
Selanjutnya diinkubasikan lagi selama 2 jam sampai semalaman pada temperatur kamar. Catatan:
natrium azida adalah sebagai inhibitor horseradish peroxidase (HRP). Jadi jangan menambahkan
natrium azida pada buffer jika menggunakan antibodi berlabel HRP untuk tujuan determinasi.
7. Cuci wells sebanyak dua kali menggunakan PBS. Pisahkan larutan pencuci menggunakan suksion
atau dipipet.
8. Tambahkan 50 L larutan antigen sampel atau standar pada masing-masing well. Semua
pengenceran yang dilakukan hendaklah menggunakan bufer pemblok (3% BSA/PBS). Inkubasikan
paling tidak selama 2 jam pada temperatur kamar dan humiditas atmosfer.
9. Cuci plate sebanyak empat kali menggunakan PBS. Pisahkan larutan pencuci dengan suksion atau
memipetnya.
10. Tambahkan antibodi kedua (antigen-konyugasi) yang berlabel. Untuk mendapatkan kuantifikasi
yang akurat penambahan antibodi kedua ini haruslah berlebih.
11. Inkubasikan selama 2 jam atau lebih pada temperatur kamar dan humiditas atmosfer.
12. Cuci beberapa kali menggunakan PBS.
13. Tambahkan substrat sesuai petunjuk pabrik, setelah diinkubasikan sesuai dengan yang
disarankan oleh pabriknya, maka dilakukan pengukuran absorbansi menggunakan ELISA plate
reader pada panjang gelombang yang sesuai.
Catatan: beberapa substrat enzim adalah sangat berbahaya karena bersifat karsinogenik Jadi tangani
sesuai dengan Material Safety Data Sheets untuk mendapatkan hasil yang maksimal ataupun
keselamatan. Untuk hasil kuantitatif badingkan signal sampel yang tidak diketahui dengan standar
sesuai dengan kurva standar yang diperoleh.
indirect elisa
a) Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya ditempelkan pada permukaan
lubang plate mikrotiter. Antigen tersebut akan menempel pada permukaan plastik dengan cara
adsorpsi. Sampel dari konsentrasi antigen yang diketahui ini akan menetapkan kurva standar yang
digunakan untuk mengkalkulasi konsentrasi antigen dari suatu sampel yang akan diuji.
b) Suatu larutan pekat dari protein non-interacting, seperti bovine serum albumin (BSA) atau kasein,
ditambahkan dalam semua lubang plate mikrotiter. Tahap ini dikenal sebagai blocking, karena protein
serum memblok adsorpsi non-spesifik dari protein lain ke plate.
c) Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi dengan sampel serum dari antigen
yang tidak diketahui, dilarutkan dalam buffer yang sama dengan yang digunakan untuk antigen
standar. Karena imobilisasi antigen dalam tahap ini terjadi karena adsorpsi non-spesifik, maka
konsentrasi protein total harus sama dengan antigen standar.
d) Plate dicuci, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang diuji dimasukkan dalam
lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen terimobilisasi pada permukaan lubang, bukan pada
protein serum yang lain atau protein yang terbloking.
e) Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi, ditambahkan dalam
lubang. Antibodi sekunder ini akan berkonjugasi menjadi enzim dengan substrat spesifik. Tahap ini
bisa dilewati jika antibodi pendeteksi berkonjugasi dengan enzim.
f) Plate dicuci untuk membuang kelebihan konjugat enzim-antibodi yang tidak terikat.
g) Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh enzim untuk mendapatkan sinyal kromogenik/
fluorogenik/ elektrokimia.
h) Hasil dikuantifikasi dengan spektrofotometer, spektrofluorometer atau alat optik/ elektrokimia
lainnya.
ELISA indirect memiliki beberapa kelemahan, antara lain :
a. Membutuhkan waktu pengujian yang relative lebih lama daripada ELISA direct karena ELISA indirect
membutuhkan 2 kali waktu inkubasi yaitu pada saat terjadi interaksi antara antigen spesifik dengan
antibody yang dinginkan dan antara antibody yang diinginkan dengan antibody sekunder tertaut
enzim signal, sedangkan pada ELISA direct hanya membutuhkan 1 kali waktu inkubasi yaitu pada
saat terjadi interaksi antara antigen yang diinginkan dengan antibody spesifik tertaut enzim signal.
Sedangkan kelebihan dari ELISA indirect antara lain :
a. Terdapat berbagai macam variasi antibody sekunder yang terjual secar komersial di pasar.
b. Immunoreaktifitas dari antibody yang diinginkan (target) tidak terpengaruh oleh penautan enzim
signal ke antibody sekunder karena penautan dilakuka pada wadah berbeda.
c. Tingkat sensitivitas meningkat karena setiap antibody yag diinginkan memiliki beberapa epitop yang
bisa berinteraksi dengan antibody sekunder.

Sandwich elisa

Tahapan dalam Sandwich ELISA adalah sebagai berikut:

a) Disiapkan permukaan untuk mengikatkan antibodi penangkap
b) Semua non spesifik binding sites pada permukaan diblokir
c) Sampel berisi antigen dimasukkan dalam plate
d) Plate dicuci untuk membuang kelebihan antigen yang tidak terikat
e) Antibodi primer ditambahkan, supaya berikatan secara spesifik dengan antigen
f) Antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim dimasukkan, yang akan berikatan dengan antibodi
primer
g) Plate dicuci, sehingga konjugat antibodi-enzim yang tidak terikat dapat dibuang
h) Ditambahkan reagen yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal berwarna/ berfluoresensi/
elektrokimia
i) Diukur absorbansinya untuk menetukan kehadiran dan kuantitas dari antigen
Kelebihan teknik ELISA sandwich
Tingkat sensitivitasnya yang relatif lebih tinggi karena antigen yang diinginkan harus dapat
berinteraksi dengan dua jenis antibody, yaitu antibody penangkap dan antibody detector,
kemampuannya menguji sampel yang tidak murni, dan mampu mengikat secara selektif antigen yang
dikehendaki. Tanpa lapisan pertama antibodi penangkap, semua jenis protein pada sampel (termasuk
protein serum) dapat diserap secara kompetitif oleh permukaan lempeng, menurunkan kuantitas
antigen yang terimobilisasi.
Namun demikian, teknik ELISA sandwich ini juga memiliki kelemahan, yaitu teknik ini hanya
dapat diaplikasikan untuk medeteksi antigen yang bersifat multivalent serta sulitnya mencari dua jenis
antibody yang dapat berinteraksi antigen yang sama pada sisi antigenic yang berbeda (epitopnya
harus berbeda)

Competitive ELISA
Tahapan pengerjaan ELISA kompetitif berbeda dari dua metode yang telah dibahas
sebelumnya, yaitu:
a) Antibodi yang tidak berlabel diinkubasi dengan kehadiran antigennya
b) Komplek antigen-antibodi ini selanjutnya ditambahkan pada lubang yang telah dilapisi antigen
c) Plate dicuci, sehingga kelebihan antibodi tercuci (semakin banyak antigen dalam sampel, semakin
sedikit antibodi yang dapat terikat pada antigen yang menempel pada permukaan lubang, karena
inilah disebut kompetisi
d) Ditambahkan antibodi sekunder yang spesifik utnuk antibodi primer. Antibodi sekunder ini
berpasangan dengan enzim
e) Substrat ditambahkan, enzim akan mengubah substrat menjadi sinyal kromogenik/ fluoresensi
.
Teknik ELISA ini memiliki beberapa kelebihan, antara lain :
Teknik pengerjaan relatif sederhana
Relatif ekonomis (karena jenis a antibodi yang digunakan hanya satu saja, sehingga menghemat
biaya untuk membeli banyak jenis antibodi)
Hasil memiliki tingkat sensitivitas yang cukup tinggi.
Dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan antigen walaupun kadar antigen tersebut sangat
rendah (hal ini disebabkan sifat interaksi antara antibodi atau antigen yang bersifat sangat spesifik)
Dapat digunakan dalam banyak macam pengujian.
 kekurangan dari teknik ELISA antara lain :
Jenis antibodi yang dapat digunakan pada uji dengan teknik ELISA ini hanya jenis antibodi
monoklonal (antibodi yang hanya mengenali satu antigen).
Harga antibodi monoklonal relatif lebih mahal daripada antibodi poliklonal, sehingga pengujian
teknik ELISA ini membutuhkan biaya yang relatif mahal.
Pada beberapa macam teknik ELISA, dapat terjadi kesalahan pengujian akibat kontrol negatif yang
menunjukkan respons positif yang disebabkan inefektivitas dari larutan blocking sehingga antibodi
sekunder atau antigen asing dapat berinteraksi dengan antibodi bertaut enzim signal dan
menimbulkan signal.
Reaksi antara enzim signal dan substrat berlangsung relatif cepat, sehingga pembacaan harus
dilakukan dengan cepat (pada perkembangannya, hal ini dapat diatasi dengan memberikan larutan
untuk menghentikan reaksi).