ELISA

Dr. Zuhrinah Ridwan, MKes, SpPK

DEFINISI
 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)
merupakan teknik biokimia yang banyak
digunakan di bidang imunologi untuk mendeteksi
adanya antibody atau antigen pada suatu sampel.
 ELISA diperkenalkan pada tahun 1971 oleh Peter
Perlmann dan Eva Engvall untuk menganalisis
adanya interaksi antigen dengan antibodidi dalam suatu
sampel dengan menggunakan enzim sebagai label.
FUNGSI

 Fungsi dari test ELISA yaitu untuk mengukur kadar

antigen atau antibodi tersebut dengan
menggunakan alat spektrofotometer.
 Spektrofotometer adalah sebuah alat yang dapat
mengukur jumlah dari cahaya yang menembus
sumuran dari microplate
 Prinsip yaitu antigen yang tidak dikenal ditempelkan
pada wel, kemudian antibodi spesifik dicuci sehingga
akan berikatan dengan antigennya. Antibodi ini terikat
dengan suatu enzim, dan pada tahap terakhir,
ditambahkan substansi yang dapat diubah oleh enzim
menjadi sinyal yang dapat dideteksi.
BEBERAPA METODE ELISA

 Direct ELISA, Digunakan untuk deteksi antigen.

 Indirect ELISA, antigen terikat pada plate. Digunakan
untuk deteksi antibody.
 Sandwich ELISA, antibodi terikat pada Plate.
Digunakan untuk deteksi antigen.
1. METODE SANDWICH

 Sandwich ELISA merupakan jenis ELISA yang dapat

digunakan untuk mengukur antigen maupun antibodi.
 Karakteristik khas dari sandwich ELISA adalah
menggunakan antibodi penangkap atau primer
antibodi.
 T

Tahapan dalam sandwich ELISA adalah sebagai berikut :

1. Disiapkan permukaan untuk mengikatkan antibodi ‘penangkap’
2. Semua non spesifik binding sites pada permukaan diblokir
3. Sampel berisi antigen dimasukkan dalam plate
4. Plate dicuci untuk membuang kelebihan antigen yang tidak terikat
5. Antibodi primer ditambahkan, supaya berikatan secara spesifik dengan antigen
6. Antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim dimasukkan, yang akan berikatan
dengan antibodi primer
7. Plate dicuci, sehingga konjugat antibodi-enzim yang tidak terikat dapat dibuang
8. Ditambahkan reagen yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal berwarna/
berfluoresensi/ elektrokimia
9. Diukur absorbansinya untuk menetukan kehadiran dan kuantitas dari antigen
LANJUTAN,,,,,,
Prinsip :
 Plate dilapisi oleh antibodi penangkap. Sampel
ditambahkan, dan beberapa antigen yang ada
berikatan dengan antibodi penangkap. Antibodi
pendeteksi berlabel enzim mengenali dan berikatan
dengan antigen. Enzim bereaksi dengan substrat
menghasilkan produk yang berwarna
 LANJUTAN,,,,,

 Kelebihan teknik ELISA sandwich ini pada dasarnya

berada pada tingkat sensitivitasnya yang relatif lebih
tinggi karena antigen yang diinginkan harus dapat
berinteraksi dengan dua jenis antibody, yaitu antibody
penangkap dan antibody detector.
 LANJUTAN,,,,

 Kelemahan teknik ELISA sandwich :

Teknik ini hanya dapat diaplikasikan untuk medeteksi
antigen yang bersifat multivalent serta sulitnya mencari
dua jenis antibody yang dapat berinteraksi antigen
yang sama pada sisi antigenic yang berbeda
(epitopnya harus berbeda)
2. METODE KOMPETISI

 Prinsip dasar dari teknik ini adalah dengan

menambahkan suatu competitor ke dalam lubang
mikrotiter. Teknik ELISA kompetitif ini dapat
diaplikasikan untuk mendeteksi keberadaan antigen
atau antibody.
Tahapan pengerjaan ELISA kompetitif berbeda dari dua metode yang telah
dibahas sebelumnya, yaitu:
1. Antibodi yang tidak berlabel diinkubasi dengan kehadiran antigennya
2. Komplek antigen-antibodi ini selanjutnya ditambahkan pada lubang
yang telah dilapisi antigen.
3. Plate dicuci, sehingga kelebihan antibodi tercuci (semakin banyak
antigen dalam sampel, semakin sedikit antibodi yang dapat terikat pada
antigen yang menempel pada permukaan lubang, karena inilah disebut
kompetisi
4. Ditambahkan antibodi sekunder yang spesifik utnuk antibodi primer.
Antibodi sekunder ini berpasangan dengan enzim
5. Substrat ditambahkan, enzim akan mengubah substrat menjadi sinyal
kromogenik/ fluoresensi.
 Dalam ELISA kompetitif, semakin tinggi konsentrasi antigen orisinal,
semakin lemah sinyal yang dihasilkan. Prinsip kerjanya dapat dilihat
pada gambar berikut ini:
3. INDIRECT ELISA

 Indirect ELISA merupakan jenis ELISA yang digunakan

untuk mendeteksi dan mengukur konsentrasi antigen
atau antibodi.
 Teknik ini memiliki karakteristik antigen tidak
menempel langsung pada antibodi detector (indirect).
Antigen akan berikatan dengan antibodi lain terlebih
dahulu. Antibodi tersebut kemudian akan berikatan
dengan antibodi yang telah dilabeli.
Tahap umum yang digunakan dalam indirect ELISA untuk
menentukan konsentrasi antibodi dalam serum adalah:
1. Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui
konsentrasinya ditempelkan pada permukaan lubang plate
mikrotiter. Antigen tersebut akan menempel pada
permukaan plastik dengan cara adsorpsi. Sampel dari
konsentrasi antigen yang diketahui ini akan menetapkan
kurva standar yang digunakan untuk mengkalkulasi
konsentrasi antigen dari suatu sampel yang akan diuji.
2. Suatu larutan pekat dari protein non-interacting,
seperti bovine serum albumin (BSA) atau kasein,
ditambahkan dalam semua lubang plate mikrotiter.
Tahap ini dikenal sebagai blocking, karena protein
serum memblok adsorpsi non-spesifik dari protein
lain ke plate.
3. Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi dengan
sampel serum dari antigen yang tidak diketahui, dilarutkan dalam buffer
yang sama dengan yang digunakan untuk antigen standar. Karena
imobilisasi antigen dalam tahap ini terjadi karena adsorpsi non-spesifik,
maka konsentrasi protein total harus sama dengan antigen standar.
4. Plate dicuci, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang
diuji dimasukkan dalam lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen
terimobilisasi pada permukaan lubang, bukan pada protein serum yang
lain atau protein yang terbloking.
5. Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang
antibodi pendeteksi, ditambahkan dalam lubang.
Antibodi sekunder ini akan berkonjugasi menjadi enzim
dengan substrat spesifik. Tahap ini bisa dilewati jika
antibodi pendeteksi berkonjugasi dengan enzim.
6. Plate dicuci untuk membuang kelebihan konjugat
enzim-antibodi yang tidak terikat.
7. Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh
enzim untuk mendapatkan sinyal kromogenik/
fluorogenik/ elektrokimia.
8. Hasil dikuantifikasi dengan spektrofotometer,
spektrofluorometer atau alat optik/
elektrokimia lainnya.
 Kerugian utama dari metode indirect ELISA adalah
metode imobilisasi antigennya non-spesifik, sehingga
setiap protein pada sampel akan menempel pada
lubang plate mikrotiter, sehingga konsentrasi analit
yang kecil dalam sampel harus berkompetisi dengan
protein serum lain saat pengikatan pada permukaan
lubang.
 Mekanisme indirect ELISA dapat dilihat pada
gambar di bawah ini
 Kelebihan indirect ELISA yaitu memiliki sensitivitas
tinggi dan sinyal amplifikasi yang tinggi.
PRINSIP DALAM GAMBAR
ALGORITMA