PRESENTASI METODA KIMIA II

PEMERIKSAAN ADRENOCORTICOTROPIC
HORMONE (ACTH) METODE ENZYME-LINKED
IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA)
Kode MK : PK 001C

PRESENTAN :
Josua Sinambela
PEMBIMBING :
M. I. Diah Pramudianti, dr., Sp.PK-K, MSc
PROGRAM PENDIDIKAN DOKTER SPESIALIS
PPDS-PK FK UNS - RS Dr. MOEWARDI
2014

TAHAP DASAR : ORIENTASI

NO

SUB STASE

TUGAS

WAKTU

TOPIK

1.

KIMIA

METODE 1

16 September
2014

PEMERIKSAAN SEX HORMONE

BINDING GLOBULIN (SHBG)
METODE CHEMILUMINESCENT
MICROPARTICLE IMMUNOASSAY
(CMIA)

2.

KIMIA

METODE 2

22 Oktober
2014

PEMERIKSAAN
ADRENOCORTICOTROPIC
HORMONE (ACTH) METODE
ENZYME-LINKED
IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA)

PENDAHULUAN
Menstimulasi sintesa
dan pelepasan
glukokortikoid dari
lapisan fasciculata
korteks adrenal

Hormon polipeptida
yang disekresikan
oleh kelenjar
pituitary anterior

(Kaplan et al., 2010)

Aksis hypothalamicpituitary-adrenal

Adrenocorticotropic
Hormone
(ACTH)

Terdiri dari 39 asam

amino berasal dari
protein
proopiomelanocortin
(POMC) di dalam
sel corticotrope

Aksis hypothalamic-pituitary-adrenal
(Anonim, 2010)

Penyakit yang berkaitan dengan kadar

ACTH abnormal (Kaplan et al., 2010)
Meningkat

Menurun

Addisons diseases or primary adrenal

insufficiency

Hipopituarism and/or secondary adrenal

insufficiency

Congenital adrenal hyperplasia

Cushings disease
Multiple endocrine neoplasia

Adrenal gland tumor

Other tumor that produce cortisol

Gold Standard :
Radio Immunoassay (RIA)
Pemeriksaaan ATCH kali ini menggunakan
metode:
Enzyme-linked immunosorbent assay
(ELISA)

Perbandingan antara metode RIA dan

ELISA dalam mengukur kadar serum
ACTH (Unnikrishnan, 2006)
RIA

ELISA

Sangat spesifik dan sangat sensitif

Menggunakan radio isotop
Bahan tidak stabil
Lebih berbahaya
Lebih mahal
Menggunakan alat pemecah radioaktif
gamma (laboratorium lengkap)
Berisiko tinggi
Kalibrasi yang lama (berhari-hari)
Tidak praktis

Sensitif
Menggunakan enzim
Lebih stabil
Lebih aman
Relatif lebih murah
Dapat dikerjakan di laboratorium kecil
Risiko lebih rendah
Kalibrasi dalam waktu lebih singkat
Lebih praktis
7

PRAANALITIK
TUJUAN
Pemeriksaan ini bertujuan untuk mengukur secara
kuantitatif ACTH dalam plasma ethylene diamine
tetraacetic acid (EDTA) yang berguna
dalam
mendeteksi peningkatan dan penurunan konsentrasi
ACTH dengan metode ELISA (two-site sandwich
technique)
Anonim, 2007

ALAT
ELISA Reader (Anonim, 2010)

ELISA Washer (Anonim, 2010)

ELISA kit (Anonim, 2011)

9

BAHAN
(Anonim, 2011)
Plasma
(EDTA)

10

Persiapan
sampel

Sampel pada pagi

hari.
Suhu 2-8C
stabil selama 8
jam.
Suhu -20C
stabil selama 4
bulan.
Hindari lebih
dari 3 kali
freeze thaw
cycles.

Persiapan
Pasien
Tidak diperbolehkan
mengkonsumsi steroid

Anonim, 2011
11

REAGEN

ISI

Anti ACTH antibody

coated microplate

Satu microplate dengan 12 x 8 strips (total 96 sumuran) yang

telah dilapisi dengan antibodi monoclonal antihuman ACTH.
Reagen ini harus disimpan pada suhu 2-8C dan stabil sampai
tanggal kadaluarsa yang tertera pada ACTH ELISA assay kit.

Horse radish peroxidase

(HRP) conjugated anti
ACTH antibody

Setiap vial mengandung 0,25 mL HRP yang telah diberi label

antibodi anti human ACTH dalam matriks protein stabil.

Enzyme linked
immunosorbent assay
wash concentrate

Setiap botol mengandung 30 mL dari 30 fold concentrate.

Larutan pencuci yang telah diencerkan ini harus disimpan pada
suhu ruangan dan akan stabil sampai masa kadaluarsanya.

Enzyme linked
immunosorbent assay
HRP substrate

Setiap botol mengandung 25 mL tetramethylbenzidine (TMB)

hidrogen peroksida. Reagen ini harus disimpan pada suhu 28C, dan stabil sampai masa kadaluarsanya.

Stop solution ELISA

Setiap botol mengandung 12 mL stop solution. Reagen ini harus

disimpan pada suhu 2-8C, dan stabil sampai masa
kadaluarsanya.
12

REAGEN

ISI

Human ACTH standard

6 vial mengandung ACTH manusia dalam serum lyophilized

bovine based matrix dengan non azide, non mercury
preservative. Standar ini harus disimpan pada suhu 2-8C, dan
stabil sampai masa kadaluarsanya. Untuk pengencerannya
mengikuti prosedur yang telah ditentukan.

Enzyme linked
immunosorbent assay
controls

2 vial mengandung ACTH manusia dalam lyophilized bovine

serum based matrix non azide preservative. Kontrol ini harus
disimpan pada suhu 2-8C dan stabil sampai masa
kadaluarsanya. Untuk pengencerannya mengikuti prosedur yang
telah ditentukan.

Tracer antibody diluents

Satu vial mengandung 5 mL buffer yang siap digunakan. Hanya

digunakan untuk tracer antibody dilution sesuai prosedur yang
telah ditentukan. Reagen ini harus disimpan pada suhu 2-8C,
dan stabil sampai masa kadaluarsanya. Untuk pengencerannya
mengikuti prosedur yang telah ditentukan.

13

Kalibrasi dan Quality control

Kalibrasi dan Quality control menggunakan
sampel kontrol setiap sebelum running.
(Anonim, 2011)

14

(Anonim, 2011)

15

Prinsip

Anonim, 2012
16

Analitik
Prosedur Pemeriksaaan:
Masukkan 200 L standard, kontrol dan sampel pasien ke dalam microwells
Segera tambahkan 25 L HRP conjugated anti ACTH antibody
Tutup plate wells, inkubasi dan putar dengan menggunakan ELISA plate
shaker selama 2 jam pada kecepatan 400 450 rpm
Cuci sumuran 5 kali dengan 350 L larutan pencuci ke dalam tiap sumuran
dan kemudian dibersihkan (microplate washer automatic)

Tambahkan 200 L ELISA HRP substrate

Tutupi plate wells dan inkubasi dalam suhu ruangan 20 menit

Segera tambahkan 50 L ELISA stop solution

Lakukan pembacaan absorbance pada 450 nm dengan reference filter 620
atau 650 nm
17

Anonim, 2011

Paska Analitik
Expected value: 1-72 pg/mL

Batasan deteksi adalah mendekati 0,4 pg/mL

Interferensi : Air yang dideionisasi dengan
polyester resins, tidak ditemukan reaksi silang
dengan komponen lain.
High dose hook effect : tidak dijumpai sampai
10.000 pg/mL
18

Presisi (Anonim, 2011)

Nilai presisi intra assay divalidasi dengan mengukur 3 sampel
kontrol dengan 16 kali pengulangan.
Sampel
1
2
3

Rerata nilai ACTH (pg/mL)

36,2
66,5
276,9

CV (%)
7,6
8,6
10,3

Nilai presisi inter assay divalidasi dengan mengukur 2 level kontrol

dengan duplikasi 16 kali dari tes terpisah
Sampel
1
2

Rerata nilai ACTH (pg/mL)

32,1
261,0

CV (%)
7,1
5,3
19

Linearitas (Anonim, 2011)

Pengenceran

Nilai pengamatan (pg/mL)

Persentase nilai perbaikan

Sampel A
1:2
1:4
1:8
1:16
Sampel B
1:2
1:4
1:8

416
231,4
102,1
52,1
26,3
155
80,3
38,6
20,5

111
98
100
101
104
100
106

1:16

9,3

96
20

SIMPULAN
Adrenocorticotropic hormone (ACTH) merupakan hormon
polipeptida yang disekresikan oleh kelenjar pituitary anterior.
Fungsi utamanya adalah menstimulasi sintesa dan pelepasan
glukokortikoid terutama kortisol dari korteks adrenal.
ACTH merupakan komponen penting dalam aksis
hypothalamic-pituitary-adrenal.
Diproduksi sebagai respon terhadap stres biologis, menstimulasi
sekresi hormon steroid glukokortikoid dari sel korteks adrenal
lapisan fasciculata.
Konsentrasi ACTH meningkat oleh AVP, stress fisik, latihan,
penyakit akut.
Gold standard untuk pemeriksaan ACTH adalah dengan
21
menggunakan metode radio immune assay (RIA).

DAFTAR PUSTAKA
Anonim, 2010. Enzyme linked immuno sorbent assay reader.
http://www.biotek.com/products/microplate_detection/elx808_absorbance_microplate_r
eader.html (diunduh 30 September 2014).
Anonim, 2011. ELISA Kit for adrenocorticotropic hormone (ACTH). http://elisaantibody.com (diunduh 30 September 2014).
Anonim, 2012. Direct and indirect ELISA protocols
http://www.eiaab.com/info/detail/456 (diunduh 30 September 2014).

Boyar RM., Witkin M., Carruth A., Ramsey J. 1979. Circadian cortisol secretory
rhythms in Cushing's disease. J Clin Endocrinol Metab. 48(5):760-5.
Kageyama K., Ikeda H., Nigawara T., Sakihara S., Suda T. 2007. Expression of
adrenocorticotropic hormone, prolactin and transcriptional factors in clinically
nonfunctioning pituitary adenoma. Endocr J. 54(6): 961-8.
22

DAFTAR PUSTAKA
Kaplan L. A., and Pesce A. J. 2010. Clinical Chemistry. 5th Edition. USA: Elsevier
Saunders Inc, pp: 672-687.
Kreek MJ., Wardlaw SL., Hartman N., Raghunath J., Friedman J., Schneider B.,
Frantz AG. 1983. Circadian rhythms and levels of beta-endorphin, ACTH, and
cortisol during chronic methadone maintenance treatment in humans. Life Sci. 33 Suppl
1:409-11.
Larry J. 2010. Harrisons endocrinology. 2nd Edition. New York: Mc Graww Hill
Medical. Pp: 103-107.
Liddle GW. 1966. An analysis of circadian rhythms in human adrenocortical secretory
activity. Trans Am Clin Climatol Assoc. 77:151-60.
Unnikrishnan MK. 2006. Radio immune assay and enzyme linked immune assay.
http://www.pitt.edu/~super7/25011-26001/25011.ppt (diunduh 30 September 2014)
23

TERIMA
KASIH
24

Anonim, 2013

25

Data absorbance ELISA ACTH (Anonim, 2011)

OD 450/650 nm Absorbance
Well ID
Std 1: 0 pg/mL
Std 2: 7,6 pg/mL
Std 3: 20 pg/mL
Std 4: 51 pg/mL
Std 5: 155 pg/mL
Std 6: 416 pg/mL
Kontrol 1
Kontrol 2

Pembacaan
0,003
0,028
0,102
0,109
0,206
0,224
0,562
0,528
1,646
1,610
3,151
3,595
0,349
0,364
2,105
1,664

Rerata

Koreksi

0,31

0,000

0,105

0,074

0,215

0,184

0,545

0,514

1,628

1,597

3,373

3,324

0,390
1,118

Hasil (pg/mL)

36,5
106,0

26

Persiapan reagen (Anonim, 2011)

Sebelum
digunakan
dibiarkan dalam
suhu ruangan,
nomor lot yang
berbeda tidak
dapat digunakan
atau
dikombinasikan.

Campurkan
standard assay dan
kontrol dengan
Anti ACTH
menambahkan 2,0
antibody coated
mL air yang telah
Tracer
microplate untuk
didemineralisasi
antibody
Konsentrat pencuci pada tiap botol
human ACTH
pengenceran
ELISA dilarutkan standar dan kontrol
1:21 dengan standard, kontrol
dengan 870 mL air selama 5 menit,
dan sampel
menambahkan
yang telah
disimpan suhu 2dengan cara
tracer
didemineralisasi
duplikasi
8C (24 jam), pada
antibody
suhu -10C (waktu
yang lama).
Hindari lebih dari
3 siklus beku

diluents

Konfigurasi
tesKonfigurasi tes

27

Hubungan antara strip yang digunakan dengan campuran

antibodi (Anonim, 2011)
Dilution Scheme

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12

Tracer Antibody
Diluent
0,4 mL
0,8 mL
1,2 mL
1,6 mL
2,0 mL
2,4 mL
2,8 mL
3,2 mL
3,6 mL
4,0 mL
4,4 mL
4,8 mL

Tracer Antibody

20 L
40 L
60 L
80 L
100 L
120 L
140 L
160 L
180 L
200 L
220 L
240L
28

Konfigurasi tes (Anonim, 2011)

ROW

STRIP 1

STRIP 2

STRIP 3

STRIP 4

STD 1

STD 5

SAMPLE 1

SAMPLE 5

STD 1

STD 5

SAMPLE 1

SAMPLE 5

STD 2

STD 6

SAMPLE 2

SAMPLE 6

STD 2

STD 6

SAMPLE 2

SAMPLE 6

STD 3

C1

SAMPLE 3

STD 3

C1

SAMPLE 3

STD 4

C2

SAMPLE 4

STD 4

C2

SAMPLE 4
29

CV = (SD/X) x 100%
Intra assay 10%
Inter assay 15%

Handoyo, 2003
30

31

32

HOOK EFFECT
Penurunan kadar analit yang tidak diharapkan pada
ujung dari kurva dosis respon

Estimasi kadar analit terlalu rendah

Handoyo, 2003

33

Figure 2. The hook effect - An excessive amount of analyte overwhelms the binding capacity of the
capture antibody. This results in an inappropriately low signal that causes erroneous low or normal
result (hooked result) for a patient with an excessively elevated serum analyte concentration.
Anonim, 2010 34

Zona
Ekivalen
Pro zone

Post zone

Rasio Ab dan Ag seimbang

Kelebihan Ab, Rasio Ab:Ag tidak

seimbang.
Pada pengenceran serum yang
rendah
Kelebihan Ag, Rasio Ab:Ag tidak
seimbang.
Pada pengenceran serum yang tinggi
Kadar Ab telah amat rendah
Handoyo, 2003

35