MAKALAH INSTRUMENTASI III

MICROPLATE READER

ATAU

Enzyme-Linked
ImmunoSorbent
Assay

DISUSUN OLEH:

1.MUHAMMAD SIDDIK

2.FARIDA BADRUM

3.SAHAWIAH

UNIVERSITAS MEGAREZKY MAKASSAR

TAHUN 2022
 KATA PENGANTAR
Puji syukur kami panjatkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa karena
dengan rahmat, karunia, serta taufik dan hidayah-Nya kami dapat menyelesaikan
makalah tentang Elisa Reader ini dengan baik meskipun banyak kekurangan
didalamnya. Dan juga kami berterima kasih pada Ibu Dosen, selaku Dosen mata
kuliah Instrumentasi III Jurusan TLM Universitas Mega Rezky Makassar yang telah
memberikan tugas ini kepada kami.Kami sangat berharap makalah ini dapat berguna
dalam rangka menambah wawasan serta pengetahuan kita mengenai elisa. Kami
juga menyadari sepenuhnya bahwa di dalam makalah ini terdapat kekurangan
dan jauh dari kata sempurna. Oleh sebab itu, kami berharap adanya kritik, saran dan
usulan demi kesempurnaan makalah yang telah kami buat di masa yang akan
datang, mengingat tidak ada sesuatu yang sempurna tanpa saran yang membangun.
Semoga makalah sederhana ini dapat dipahami bagi siapapun yang
membacanya.
Sekiranya makalah yang telah disusun ini dapat berguna bagi kami sendiri
maupun orang yang membacanya. Sebelumnya kami mohon maaf apabila terdapat
kesalahan kata-kata yang kurang berkenan dan kami memohon kritik dan saran
yang membangun dari Anda demi perbaikan makalah ini di waktu yang akan
datang.
Makassar, 06 Oktober 2022

Penyusun
 BAB I
PENDAHULUAN

I. Sejarah Penemuan dan Prinsip Dasar Teknik ELISA

Teknik ELISA pertama kali diperkenalkan pada tahun 1971 oleh Peter Perlmann
dan Eva Engvall. Mereka menggunakan teknik ELISA ini dalam bidang imunologi
(ELISA konvensional) untuk menganalisis interaksi antara antigen dan antibodi di
dalam suatu sampel, dimana interaksi tersebut ditandai dengan menggunakan suatu
enzim yang berfungsi sebagai pelapor/ reporter/ signal.
Prinsip dasar dari teknik ELISA ini secara simpel dapat dijabarkan sebagai
berikut:
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu teknik biokimia
yang terutama digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran
antibodi atau antigen dalam suatu sampel. ELISA telah digunakan sebagai alat
diagnostik dalam bidang medis, patologi tumbuhan, dan juga berbagai bidang
industri.
Penggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifitas
untuk antigen tertentu. Sampel dengan jumlah antigen yang tidak diketahui
diimobilisasi pada suatu permukaan solid(biasanya berupa lempeng mikrotiter
polistirene), baik yang non-spesifik (melalui penyerapan pada permukaan) atau
spesifik (melalui penangkapan oleh antibodi lain yang spesifik untuk antigen yang
sama, disebut ‘sandwich’ ELISA).
Setelah antigen diimobilisasi, antibodi pendeteksi ditambahkan, membentuk
kompleks dengan antigen. Antibodi pendeteksi dapat berikatan juga dengan enzim,
atau dapat dideteksi secara langsung oleh antibodi sekunder yang berikatan dengan
enzim melalui biokonjugasi. Di antara tiap tahap, plate harus dicuci dengan larutan
deterjen lembut untuk membuang kelebihan protein atau antibodi yang tidak
terikat. Setelah tahap pencucian terakhir, dalam plate ditambahkan substrat
enzimatik untuk memproduksi sinyal yang visibel, yang menunjukkan kuantitas
antigen dalam sampel. Teknik ELISA yang lama menggunakan substrat kromogenik,
meskipun metode metode terbaru mengembangkan substrat fluorogenik yang jauh
lebih sensitif. Dalam perkembangan selanjutnya, selain digunakan sebagai uji
kualitatif untuk mengetahui keberadaan suatu antibodi atau antigen dengan
menggunakan antibodi atau antigen spesifik, teknik ELISA juga dapat diaplikasikan
dalam uji kuantitatif untuk mengukur kadar antibodi atau antigen yang diuji dengan
menggunakan alat bantu berupa spektrofotometer atau dengan cara menentukan
jumlah penambahan atau kadar antibodi atau antigen, sehingga dapat dibuat suatu
kurva standar dan kadar antigen atau antibodi yang tidak diketahui dapat
ditentukan.
ELISA tradisional secara khusus memiliki reporter dan substrat yang
menghasilkan beberapa bentuk perubahan warna yang dapat diamati untuk
mengetahui kehadiran antigen atau analyte. Bentuk teknik ELISA terbaru seperti
teknik flurogenic,electro chemiluminescent , dan real-time PCR dibuat untuk
mengetahui sinyal kuantitatif. Metode ini dapat memberikan berbagai keuntungan
diantaranya sensitifitas yang tinggi dan bersifat multiplexing (Leng et al , 2008).
 BAB II
ELISA
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu teknik biokimia yang
terutama digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau
antigen dalam suatu sampel. ELISA telah digunakan sebagai alat diagnostik dalam bidang
medis, patologi tumbuhan, dan juga berbagai bidang industri

II. Kelebihan & Kekurangan Teknik ELISA

Teknik ELISA ini memiliki beberapa kelebihan, antara lain:
 Teknik pengerjaan relatif sederhana.
 Relatif ekonomis (karena jenis antibodi yang digunakan hanya satu saja,
sehingga menghemat biaya untuk membeli banyak jenis antibodi)
 Hasil memiliki tingkat sensitivitas yang cukup tinggi.
 Dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan antigen walaupun kadar
antigen tersebut sangat rendah (hal ini disebabkan sifat interaksi antara
antibodi dan antigen yang bersifat sangat spesifik)
 Dapat digunakan dalam banyak macam pengujian.
Sedangkan kekurangan dari teknik ELISA antara lain:
 Jenis antibodi yang dapat digunakan pada uji dengan teknik ELISA ini hanya
jenis antibodi monoklonal (antibodi yang hanya mengenali satu antigen)
 Harga antibodi monoklonal relatif lebih mahal daripada antibodi poliklonal,
sehingga pengujian teknik ELISA ini membutuhkan biaya yang relatif cukup
mahal.
 Pada beberapa macam teknik ELISA, dapat terjadi kesalahan pengujian
akibat kontrol negatif yang menunjukkan respons positif yang disebabkan
inefektivitas dari larutan blocking sehingga antibodi sekunder atau antigen
asing dapat berinteraksi dengan antibodi bertaut enzim signal dan
menimbulkan signal.
 Reaksi antara enzim signal dan substrat berlangsung relatif cepat, sehingga
pembacaan harus dilakukan dengan cepat (pada perkembangannya, hal ini
dapat diatasi dengan memberikan larutan untuk menghentikan reaksi).
III. Alat & Bahan Yang Digunakan
Bahan
Kit ELISA yang terdiri dari :
 plate ELISA yang telah dilapisi (coated) dengan antibodi atau antigen
  Antigen yang dimurnikan (jika sampel yang hendak dideteksi atau
dikuantifikasi berupa antibodi).
 Antibodi yang dimurnikan (jika sampel yang hendak dideteksi atau
dikuantifikasi berupa antigen).
 Larutan standard (kontrol positif dan negatif).
 Sampel yang ingin dites.
 standar antibiotik
 Konjugate atau enzim penanda
 Substrat yang bersifat spesifik terhadap enzim signal
 Larutan pencuci ( Buffer )
 Larutan penghenti reaksi (stop solution)

Peralatan
- Timbangan
- Gelas ukur
- Single mikro pipet 5-50 μl, 50-1000 μl
- Multi channel mikro pipet 5-50 μl, 50-300 μl
- Bak reservoar
- Homogenizer/stomacher/mortar,
- Sentrifuger atau filter
- Penangas air
- Inkubator
- ELISA Plate washer atau labu semprot
- ELISA Plate Reader dengan filter panjang gelombang 400-600 nm untuk
pengukuran kuantitatif
- Komputer
IV. Macam-Macam Teknik ELISA
Secara umum, teknik ELISA dibedakan menjadi dua jenis, yaitu teknik ELISA
kompetitif yang menggunakan konjugat antigen-enzim atau konjugat antibodi-
enzim, dan teknik ELISA nonkompetitif yang menggunakan dua antibodi (primer dan
sekunder). Pada teknik ELISA nonkompetitif, antibodi kedua (sekunder) akan
dikonjugasikan dengan enzim yang berfungsi sebagai signal. Teknik ELISA
nonkompetitif ini seringkali disebut sebagai teknik ELISA sandwich.
A. Indirect ELISA
Tahap umum yang digunakan dalam indirect ELISA untuk menentukan
konsentrasi antibodi dalam serum adalah:
1. Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya ditempelkan
pada permukaan lubang plate mikrotiter. Antigen tersebut akan menempel pada
permukaan plastik dengan cara adsorpsi. Sampel dari konsentrasi antigen yang
diketahui ini akan menetapkan kurva standar yang digunakan untuk mengkalkulasi
konsentrasi antigen dari suatu sampel yang akan diuji.
2. Suatu larutan pekat dari protein non-interacting, seperti bovine serum
albumin (BSA) atau kasein, ditambahkan dalam semua lubang plate mikrotiter.
Tahap ini dikenal sebagai blocking, karena protein serum memblok adsorpsi non-
spesifik dari protein lain ke plate.
3. Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi dengan
sampel serum dari antigen yang tidak diketahui, dilarutkan dalam buffer yang sama
dengan yang digunakan untuk antigen standar. Karena imobilisasi antigen dalam
tahap ini terjadi karena adsorpsi non-spesifik, maka konsentrasi protein total harus
sama dengan antigen standar.
4. Plate dicuci, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang diuji
dimasukkan dalam lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen terimobilisasi
pada permukaan lubang, bukan pada protein serum yang lain atau protein yang
terbloking.
5. Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi,
ditambahkan dalam lubang. Antibodi sekunder ini akan berkonjugasi menjadi enzim
dengan substrat spesifik. Tahap ini bisa dilewati jika antibodi pendeteksi
berkonjugasi dengan enzim.
6. Plate dicuci untuk membuang kelebihan konjugat enzim-antibodi yang tidak
terikat.
7. Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh enzim untuk mendapatkan
sinyal kromogenik/ fluorogenik/ elektrokimia.
8. Hasil dikuantifikasi dengan Elisa Reader / spektrofotometer,
spektrofluorometer atau alat optik/ elektrokimia lainnya.
Enzim bertindak sebagai amplifier, bahkan jika hanya sedikit antibodi terikat
enzim yang tetap terikat, molekul enzim akan memproduksi berbagai molekul sinyal.
Kerugian utama dari metode indirect ELISA adalah metode imobilisasi antigennya
non-spesifik, sehingga setiap protein pada sampel akan menempel pada lubang
plate mikrotiter, sehingga konsentrasi analit yang kecil dalam sampel harus
berkompetisi dengan protein serum lain saat pengikatan pada permukaan lubang.
Mekanisme indirect ELISA dapat dilihat pada gambar di bawah ini.
B. Sandwich ELISA
Tahapan dalam Sandwich ELISA adalah sebagai berikut:
1. Disiapkan permukaan untuk mengikatkan antibodi ‘penangkap’
2. Semua non spesifik binding sites pada permukaan diblokir
3. Sampel berisi antigen dimasukkan dalam plate
4. Plate dicuci untuk membuang kelebihan antigen yang tidak terikat
5. Antibodi primer ditambahkan, supaya berikatan secara spesifik dengan
antigen
6. Antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim dimasukkan, yang akan
berikatan dengan antibodi primer
7. Plate dicuci, sehingga konjugat antibodi‐enzim yang tidak terikat dapat
dibuang
8. Ditambahkan reagen yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal
berwarna/ berfluoresensi/ elektrokimia
9. Diukur absorbansinya untuk menetukan kehadiran dan kuantitas dari antigen
Keuntungan utama dari metode sandwich ELISA adalah kemampuannya
menguji sampel yang tidak murni, dan mampu mengikat secara selektif antigen yang
dikehendaki. Tanpa lapisan pertama antibodi penangkap, semua jenis protein pada
sampel (termasuk protein serum) dapat diserap secara kompetitif oleh permukaan
lempeng, menurunkan kuantitas antigen yang terimobilisasi. Prinsip kerja sandwich
ELISA dapat dilihat pada skema berikut ini:
 Dalam ELISA sandwich, terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi tingkat
sensitivitas dari hasil pengujian, antara lain:
 Banyak molekul antibodi penangkap yang berhasil menempel pada dinding
lubang microtiter
 Afinitas dari antibodi penangkap dan antibodi detektor terhadap antigen
Sebenarnya, teknik ELISA sandwich ini merupakan pengembangan dari teknik
ELISA terdahulu, yaitu ELISA direct. Kelebihan teknik ELISA sandwich ini pada
dasarnya berada pada tingkat spesitifitasnya yang relatif lebih tinggi karena antigen
yang diinginkan harus dapat berinteraksi dengan 2 jenis antibodi, yaitu antibodi
penangkap dan antibodi detektor. Namun demikian, teknik ELISA sandwich ini juga
memiliki kelemahan, yaitu teknik ini hanya dapat diaplikasikan untuk mendeteksi
antigen yang bersifat multivalent serta sulitnya mencari dua jenis antibodi yang
dapat berinteraksi antigen yang sama pada sisi antigenic yang berbeda (epitopnya
harus berbeda).
V. Contoh Langkah Kerja Teknik ELISA
Secara singkat tahapan kerja dalam metode ELISA dapat digambarkan sebagai
berikut:
 BAB III
PENUTUP

3.1 Kesimpulan
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu teknik biokimia yang
terutama digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau
antigen dalam suatu sampel .
3.2 Saran
Adapun saran yang dapat kami berikan adalah: Hendaknya pendalaman materi
mengenai Elisa ini dapat benar-benar dipahami dan dapat memudahkan khususnya
untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu sampel