BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Imunologi adalah ilmu yang mempelajari sistem imunitas tubuh manusia

maupun hewan, merupakan disiplin ilmu yang dalam perkembangannya berakar

dari pencegahan dan pengobatan penyakit infeksi. Sedangkan Serologi ialah ilmu

yang mempelajari reaksi antigen antibody secara invitro. Pemeriksaan serologik

sering dilakukan sebagai upaya menegakkan diagnosis. Walaupun saat ini

pemeriksaan serologic tidak terbatas pada penyakit infeksi, namun untuk

menunjang diagnosis penyakit infeksi memang hal yang sering dilkukan.

Memungkinkan dilakukannya pengamatan secara in vitro terhadap perubahan

kompleksantigen-antibodi.

Teknik ELISA pertama kali diperkenalkan pada tahun 1971 oleh Peter

Perlmann dan Eva Engvall mereka menggunakan teknik ELISA ini dalam bidang

imunologi ELISA konvensional untuk menganalisis interaksi antara antigen dan

antibodi di dalam suatu sampel dimana interaksi tersebut ditandai dengan

menggunakan suatu enzim yang berfungsi sebagai pelapor reporter signal.

ELISA adalah suatu teknik biokimia yang terutama digunakan dalam bidang

imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu sampel.

ELISA telah digunakan sebagai alat diagnostik dalam bidang medis, patologi

tumbuhan, dan juga berbagai bidang industri. Penggunaan ELISA melibatkan

setidaknya satu antibodi dengan spesifitas yang lebih tinggi dibandingkan metode

imun lainnya.
 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) merupakan suatu teknik

biokimia untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu sampel.

Penggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifitas untuk

antigen tertentu. ELISA terdiri atas tiga macam yaitu Direct ELISA, Indirect

ELISA, dan Sandwich ELISA.

Direct ELISA merupakan jenis ELISA yang digunakan untuk mendeteksi dan

mengukur konsentrasi suatu antigen. Antigen yang akan dideteksi akan berikatan

langsung (direct) dengan antibodi detector (antibodi yang telah dilabeli oleh

enzim reporter). Antibodi yang digunakan pada teknik direct ELISA berjumlah

satu buah. Kelebihan dari direct ELISA yaitu Cepat dan tidak terdapat Cross

Reaksi dengan antibodi sekunder. Akan tetapi, direct ELISA memiliki

kekurangan yaitu harga pelabelan antibodi primer yang mahal, tidak ada

fleksibilitas pemilihan antibodi primer, dan sinyal amplifikasinya sedikit.

Indirect ELISA merupakan jenis ELISA yang digunakan untuk mendeteksi

dan mengukur konsentrasi antigen atau antibodi. Teknik tersebut memiliki

karakteristik yaitu antigen tidak menempel langsung pada antibodi detector

(indirect). Antigen akan berikatan dengan antibodi lain terlebih dahulu. Antibodi

tersebut kemudian akan berikatan dengan antibodi yang telah dilabeli. Kelebihan

indirect ELISA yaitu memiliki sensitivitas tinggi dan sinyal amplifikasi yang

tinggi. Kekurangan indirect ELISA yaitu membutuhkan waktu yang lama dan

terjadi cross reaksi terjadi.

Berdasarkan uraian diatas maka penulis akan membahas tentang Metode

ELISA dalam mendeteksi Antibodi.

1.2 Rumusan Masalah

1. Apa saja jenis-jenis metode ELISA?

2. Bagaimana prinsip pemeriksaan ELISA Indirect?

3. Apa Kelebihan dan Kekurangan dari pemeriksaan ELISA dalam mendeteksi

Antibodi (Indirect)?

1.3 Tujuan Penulisan

1. Untuk mengetahui jenis-jenis metode ELISA

2. Untuk mengetahui prinsip pemeriksaan ELISA Indirect

3. Untuk mengetahui Kelebihan dan Kekurangan dari pemeriksaan ELISA

dalam mendeteksi Antibodi (Indirect)

 BAB II

PEMBAHASAN

2.1 Pengertian ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu teknik biokimia

yang terutama digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran

antibodi atau antigen dalam suatu sampel. ELISA telah digunakan sebagai alat

diagnostik dalam bidang medis, patologi tumbuhan, dan juga berbagai

bidang industri. Dalam pengertian sederhana, sejumlah antigen yang tidak

dikenal ditempelkan pada suatu permukaan, kemudian antibodi spesifik dicucikan

pada permukaan tersebut, sehingga akan berikatan dengan antigennya.

Antibodi initerikat dengan suatu enzim, dan pada tahap terakhir, ditambahkan

substansi yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal yang dapat dideteksi.

Dalam ELISA fluoresensi, saat cahaya dengan panjang gelombang tertentu

disinarkan pada suatu sampel, kompleks antigen/antibodi akan berfluoresensi

sehingga jumlah antigen pada sampel dapat disimpulkan berdasarkan besarnya

fluoresensi (Mufidah, dkk, 2015).

Penggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifitas

untuk antigen tertentu. Sampel dengan jumlah antigen yang tidak diketahui

diimobilisasi pada suatu permukaan solid (biasanya berupa lempeng

mikrotiterpolistirene), baik yang non-spesifik (melalui penyerapan pada

permukaan) atau spesifik (melalui penangkapan oleh antibodi lain yang

spesifik untuk antigen yang sama, disebut ‘sandwich’ ELISA). Setelah antigen

diimobilisasi, antibody pendeteksi ditambahkan, membentuk kompleks dengan

 antigen. Antibodi pendeteksi dapat berikatan juga dengan enzim, atau dapat

dideteksi secara langsung oleh antibodi sekunder yang berikatan dengan

enzim melalui biokonjugasi. Di antara tiap tahap, plate harus dicuci dengan

larutan deterjen lembut untuk membuang kelebihan protein atau antibodi

yang tidak terikat. Setelah tahap pencucian terakhir, dalam plate ditambahkan

substrat enzimatik untuk memproduksi sinyal yang visibel, yang menunjukkan

kuantitas antigen dalam sampel. Teknik ELISA yang lama menggunakan

substrat kromogenik, meskipun metode-metode terbaru mengembangkan substrat

fluorogenik yang jauh lebih sensitive (Mufidah, dkk, 2015).

2.2 Jenis-Jenis Metode ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

Secara umum, teknik ELISA dibedakan menjadi dua jenis, yaitu teknik

ELISA kompetitif yang menggunakan konjugat antigen-enzim atau konjugat

antibodi-enzim, dan teknik ELISA non kompetitif yang menggunakan dua

antibodi (primer dan sekunder). Pada teknik ELISA nonkompetitif, antibody

kedua (sekunder) akan dikonjugasikan dengan enzim yang berfungsi sebagai

signal. Teknik ELISA nonkompetitif ini seringkali disebut sebagai teknik ELISA

sandwich (Mufidah, dkk, 2015).

Dewasa ini, teknik ELISA telah berkembang menjadi berbagia macam jenis

teknik. Perkembangan ini didasari pada tujuan dari dilakukannya uji dengan

teknik ELISA tersebut sehingga dapat diperoleh hasil yang optimal. Berikut ini

adalah beberapa macam teknik ELISA yang relatif sering digunakan, antara lain :

ELISA Direct, ELISA Indirect, ELISA Sandwich, dan lain-lain (Mufidah, dkk,

2015).
2.3 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) Indirect

ELISA Indirect ini pada dasarnya juga merupakan teknik ELISA yang paling

sederhana, hanya saja dalam teknik ELISA indirect yang dideteksi dan diukur

konsentrasinya merupakan antibody. ELISA indirect menggunakan suatu antigen

spesifik (monoklonal) serta antibody sekunder spesifik tertaut enzim signal untuk

mendeteksi keberadaan antibody yang diinginkan pada sampel yang diuji

(Rachmawai, dkk, 2013).

Tahap umum yang digunakan dalam indirect ELISA untuk

mendeterminasi konsentrasi antibodi dalam serum adalah: (Rachmawai, dkk,

2013).

2.3.1 Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya

ditempelkan pada permukaan lubang plate mikrotiter. Antigen tersebut

akan menempel pada permukaan plastik dengan cara adsorpsi. Sampel

dari konsentrasi antigen yang diketahui ini akan menetapkan kurva standar

yang digunakan untuk mengkalkulasi konsentrasi antigen dari suatu

sampel yang akan diuji.

2.3.2 Suatu larutan pekat dari protein non-interacting, seperti bovine serum

albumin (BSA) atau kasein, ditambahkan dalam semua lubang

platemikrotiter. Tahap ini dikenal sebagai blocking, karena protein serum

memblok adsorpsi non-spesifik dari protein lain ke plate.

2.3.3 Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi dengan

sampel serum dari antigen yang tidak diketahui, dilarutkan dalam buffer

yang sama dengan yang digunakan untuk antigen standar. Karena

 imobilisasi antigen dalam tahap ini terjadi karena adsorpsi non-spesifik,

maka konsentrasi protein total harus sama dengan antigen standar.

2.3.4 Plate dicuci, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang

diuji dimasukkan dalam lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen

terimobilisasi pada permukaan lubang, bukan pada protein serum yang

lain atau protein yang terbloking.

2.3.5 Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi,

ditambahkan dalam lubang. Antibodi sekunder ini akan berkonjugasi

menjadi enzim dengan substrat spesifik. Tahap ini bisa dilewati jika

antibodi pendeteksi berkonjugasi dengan enzim.

2.3.6 Plate dicuci untuk membuang kelebihan konjugat enzim-antibodi yang

tidak terikat.

2.3.7 Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh enzim untuk mendapatkan

sinyal kromogenik/fluorogenik/elektrokimia.

2.3.8 Hasil dikuantifikasi dengan spektrofotometer, spektrofluorometer atau

alatoptik/elektrokimia lainnya.

Enzim bertindak sebagai amplifier, bahkan jika hanya sedikit antibodi terikat

enzim yang tetap terikat, molekul enzim akan memproduksi berbagai molekul

sinyal. Kerugian utama dari metode indirect ELISA adalah metode imobilisasi

antigennya non-spesifik, sehingga setiap protein pada sampel akan

menempel pada lubang plate mikrotiter, sehingga konsentrasi analit yang kecil

dalam sampel harus berkompetisi dengan protein serum lain saat pengikatan pada
 permukaan lubang. ELISA indirect dapat dilihat pada gambar berikut :

(Rachmawai, dkk, 2013).

Gambar 2.3 Proses Kerja ELISA Teknik Indirect

2.4 Kelemahan dan Kelebihan ELISA Teknik Indirect

2.4.1 Kelemahan ELISA Teknik Indirect

ELISA indirect memiliki kelemahan, antara lain: membutuhkan

waktu pengujian yang relative lebih lama daripada ELISA direct karena

ELISA indirect membutuhkan 2 kali waktu inkubasi yaitu pada saat

terjadi interaksi antara antigen spesifik dengan antibody yang dinginkan

dan antara antibody yang diinginkan dengan antibody sekunder tertaut

enzim signal, sedangkan pada ELISA direct hanya membutuhkan 1 kali

waktu inkubasi yaitu pada saat terjadi interaksi antara antigen yang

diinginkan dengan antibody spesifik tertaut enzim signal (Rachmawai, dkk,

2013).
 2.4.2 Kelebihan ELISA Teknik Indirect

Kelebihan dari ELISA indirect antara lain : (Rachmawai, dkk, 2013).

1. Terdapat berbagai macam variasi antibody sekunder yang terjual secara

komersial di pasar.

2. Immunoreaktifitas dari antibody yang diinginkan (target) tidak

terpengaruh oleh penautan enzim signal ke antibody sekunder karena

penautan dilakukan pada wadah berbeda.

3. Tingkat sensitivitas meningkat karena setiap antibody yang diinginkan

memiliki beberapa epitop yang bisa berinteraksi dengan antibody

sekunder.

2.5 Prinsip Kerja ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

Prinsip dasar dari teknik ELISA ini secara simple dapat dijabarkan sebagai

berikut : Pertama antigen atau antibodi yang hendak diuji ditempelkan pada suatu

permukaan yang berupa microtiter. Penempelan tersebut dapat dilakukan melalui

dua cara, yaitu penempelan secara non spesifik dengan adsorbs ke permukaan

microtiter, dan penempelan secara spesifik dengan menggunakan antibody atau

antigen lain yang bersifat spesifik dengan antigen atau antibodi yang diuji (cara

ini digunakan pada teknik ELISA sandwich). Selanjutnya antibodi atau antigen

spesifik yang telah ditautkan dengan suatu enzim signal (disesuaikan dengan

sampel => bila sampel berupa antigen, maka digunakan antibodi spesifik ,

sedangkan bila sampel berupa antibodi, maka digunakan antigen spesifik)

dicampurkan ke atas permukaan tersebut, sehingga dapat terjadi interaksi antara

antibodi dengan antigen yang bersesuaian. Kemudian ke atas permukaan tersebut

 dicampurkan suatau substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal. Pada saat

substrat tersebut dicampurkan ke permukaan, enzim yang bertaut dengan antibodi

atau antigen spesifik yang berinteraksi dengan antibodi atau antigen sampel akan

bereaksi dengan substrat dan menimbulkan suatu signal yang dapat dideteksi.

Pada ELISA flourescense misalnya, enzim yang tertaut dengan antibodi atau

antigen spesifik akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang

berupa pendaran flourescense (Suryadi, 2009).

2.6 Contoh Cara Kerja ELISA Teknik Indirect

Berikut ini adalah contoh langkah kerja pendeteksian antibodi ELISA teknik

indirect, yaitu: (Suryadi, 2009).

1. Melapisi mikrotiter plate dengan antigen yang sudah dimurnikan dengan

membiarkan larutan berisi antigen menempel pada dinding/permukaan selama

30-60 menit.

2. Membilas antigen yang tidak terikat dengan buffer.

3. Melapisi sisi-sisi tertentuyang mungkin tidak spesifik dilekati oleh antigen

dengan protein yang tidak berhubungan/ tidak spesifik (seperti larutan susu

bubuk).

4. Membilas protein yang tidak melekat.

5. Menambahkan sampel serum yang akan dideteksi antibodinya dan

membiarkan antibody spesifik untuk berikatan dengan antigen.

6. Membilas antibody yang tidak terikat.

7. Menambahkan anti-Ig yang akan berikatan pada daerah Fc pada antibody

yang spesifik (sebagai contoh, anti-rantai gamma manusia yang berikatan

 dengan IgG manusia). Daerah Fc pada anti-Ig akan berikatan secara kovalen

dengan enzim.

8. Membilas kompleks antibody-enzim yang tidak terikat.

9. Menambahkan substrat chromogenic: substrat yang tidak berwarna yang

terikat ke enzim akan dikonversi menjadi produk.

10. Inkubasi sampai muncul warna.

11. Ukur dengan spectrometer. Jika semakin pekat warna yang dideteksi, maka

makin besar kadar antibody spesifik dalam sampel.

 BAB III
PENUTUP

3.1 Kesimpulan

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu teknik biokimia

yang terutama digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran

antibodi atau antigen dalam suatu sampel. Teknik pemeriksaan Metode ELISA

terbagi atas 3 yaitu ELISA Direct, ELISA Indirect, ELISA Sandwich, dan lain-

lain.

Prinsip dasar dari pemeriksaan ELISA yaitu interaksi antara antigen dan

antibody yang teradsorbsi secara pasif pada permukaan fase padat dengan

menggunakan konjugat antibody atau antigen yang dilabel enzim. Enzi mini akan

bereaksi dengan substrat dan menghasilkan warna. Warna yang timbul dapat

ditentukan secara kualitatif dengan pandangan mata atau kuantitatif dengan

pembacaan nilai absorbansi.

Kelebihan dari metode tingkat sensitifitas yang tinggi serta terdapat berbagai

macam variasi antibody sekunder sedangkan kekurangan dari metode ini yaitu

membutuhkan waktu pengujian yang relative lebih lama.

 DAFTAR PUSTAKA

Mufidah, T., Wibowo,H., Subekti, D.T. 2015. Pengembangan Metode Elisa dan Teknik
Deteksi Cepat dengan Imunostik Antibodi Anti Aeromonas hydrophila
pada Ikan Mas (Cyprinid carpio). Vol.10.

Rachmawai, S., Widiyanti, P.M, dan Munawar, H. 2013. Pengembangan Indirect

Dipstick ELISA untuk Deteksi Aflatoksin B1 pada Pakan dan Jagung
Vol.30 (2).

Suryadi, Y., Manzila, Y dan Machmud, M. 2009. Potensi Pemanfaatan Perangkat

Diagnostik ELISA serta Variannya untuk Deteksi Patogen Tanaman. Vol.
5(1).