LAPORAN PRAKTIKUM IMUNOSEROLOGI II

ELISA UJI SANDWICH

Nama : Julia Yedy Metuduan

Nim : 18 3145 353 160

Kelas : 2018 D

Kelompok : VI (Enam)

PROGRAM STUDI DIV TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIS

FAKULTAS TEKNOLOGI KESEHATAN
UNIVERSITAS MEGA REZKY MAKASSAR
2020
 BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Serum adalah bagian darah yang tersisa setelah darah membeku.
Pembekuan mengubah semua fibrinogen menjadi fibrin dengan
menghabiskan faktor V, VIII dan protombin. Faktor pembekuan lain dan
proteinyang tidak ada hubungan dengan hemoestatis tetap ada didalam serum
dengan kadar sama seperti dalam plasma (Sibiyono dkk, 2016)
ELISA merupakan suatu uji serologik yang menggunakan kombinasi
antara antibodi spesifik dengan enzim yang berfungsi sebagai pelacak
keberadaan antigen. Adanya ikatan antibodi dan antigen dapat dideteksi
melalui penambahan substrat yang akan terurai oleh enzim penanda tersebut
dan dapat dilihat secara langsung melalui perubahan warna atau dengan
menggunakan spektrofotometer (Bunyamin dkk, 2015).
Metode ELISA merupakan uji biokimia yang menggunakan antibodi dan
perubahan warna untuk identifikasi untuk suatu substrat, biasanya antigen,
dalam sampel cair. ELISA telah digunakan untuk alat diagnosa dalam
kesehatan dan uji kontrol kualitas pada berbagai industri (Sudjadi dan
Rohman, 2018).
ELISA adalah suatu teknik deteksi dengan metode serologis yang
berdasarkan atas reaksi spesifik antara antigen dan antibodi, mempunyai
sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi dengan menggunakan enzim sebagai
indikator. Prinsip dasar ELISA adalah analisis interaksi antara permukaan
fase padat dengan menggunakan konjugat antibodi atau antigen yang dilabel
enzim. Enzim ini akan bereaksi dengan substrat dan menghasilkan warna.
Warna yang timbul dapat ditentukan secara kualitatif dengan pandangan mata
atau kuantitatif dengan pembacaan nilai absorbansi (OD) pada ELISA plate
reader (Iromo dan Farisa 2014).
Saat ini, ELISA banyak digunakan untuk mendeteksi patogen tanaman,
khususnya pada bahan tanaman yang di produksi secara vegetatif. Secara
umum, prosedur ELISA yang banyak digunakan dalam virologi tumbuhan
adalah, ELISA langsung, ELISA tak langsung dan ELISA penangkapan
antigen atau ELISA lapis ganda (sandwich) (Akin, 2006).
Oleh karena itu dilakukan pengujian ini untuk melihat respon antibodi
sehingga terbentuk antibodi yang dapat diukur dengan metode ELISA ini atau
untuk melihat antibodi atau antigen tertentu yang ada dalam sampel.
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Sebelum ELISA dikembangkan, hanya ada radioimmunoassay, suatu teknik
yang menggunakan antigen atau antibodi berlabel radioaktif. Pada
radioimmuassay, pancaran sinar radioaktif memberikan sinyal yang menunjukan
apakah ada antigen atau antibodi tertentu pada sampel. Radioimmunoassay
dipublikasikan oleh rosalyn Sussman Yalow dan Solomon Berson pada 1960
(Sudajadi dan Rohman, 2018).
Sistem ELISA yang lebih baru menggunakan reporter flourogen,
elektrokemilumisen untuk menghasilkan sinyal yang kuantitatif. Reporter baru ini
mempunyai beberapa kelebihan, yakni lebih peka dan dapat digunakan secara
bersamaan (multipleks). Dalam istilah teknis, cara uji baru ini bukan ELISA,
karena bukan “enzyme-linked”, melainkan berhubungn dengan reporter nonenzim.
Namun, prinsip umunya serupa maka kemudian dikelompokkan sebagai ELISA.\
(Sudajadi dan Rohman, 2018).
Pada 2012 muncul uji ultrasensitif, yang berdasarkan ELISA menggunakan
nanopartikel sebagai reporter kromogen dengan perubahan warna yang dapat
diamati dengan jumlah analit dalam satuan attogram. Hasil positif berwarna
birudan negatif berwarna merah. Deteksi ini hanya dapat menunjukkan apakah
ada analit yang dituju, bukan konsentrasinya (Sudajadi dan Rohman, 2018).
Metode ELISA merupakan uji biokimia yang mengandung antibodi dan
perubahan warna untuk identifikasi suatu substrat, biasanya antigen, dalam sampel
cair. ELISA telah digunakan untuk alat diagnosa dalam kesehatan dan uji kontrol
kualitas pada berbagai industri. Antigen dalam sampel ditempelkan pada
permukaan plastik dan kemudian ditambahkan antibodi spesifik sehingga
mengikat antigen. Pada antibodi ini telah dikatakan suatu enzim. Pada tahap
terakhir ditambahkan senyawa yang merupakan substrat enizm. Reaksi yang
terjadi pada umumnya perubahan warna senyawa tersebut yang merupakan sinyal
yang diukur (Sudajadi dan Rohman, 2018).
Uji kekebalan enzimatis sering kali disebut enzyme-linked immuno-sorbent
assay (ELISA) yang menghubungkan spesifitas antibodi dengan kepekaan uji
enzimatis dengan spektrofotometer biasa atau antigen dilekatkan pada enzim yang
mudah ditera. Ciri utama dari teknik ini adalah dipakai indikator enzim untuk
reaksi imunologi (Iromo dan Farisa 2014).
ELISA merupakan suatu uji serologik yang menggunakan kombinasi antara
antibodi spesifik dengan enzim yang berfungsi sebagai pelacak keberadaan
antigen.Adanya ikatan antibodi dan antigen dapat dideteksi melalui penambahan
substrat yang akan terurai oleh enzim penanda tersebut dan dapat dilihat secara
langsung melalui perubahan warna atau dengan menggunakan spektrofotometer
(Bunyamin dkk, 2015).
ELISA adalah suatu teknik deteksi dengan metode serologis yang
berdasarkan atas reaksi spesifik antara antigen dan antibodi, mempunyai
sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi dengan menggunakan enzim sebagai
indikator. Prinsip dasar ELISA adalah analisis interaksi antara permukaan fase
padat dengan menggunakan konjugat antibodi atau antigen yang dilabel enzim.
Enzim ini akan bereaksi dengan substrat dan menghasilkan warna. Warna yang
timbul dapat ditentukan secara kualitatif dengan pandangan mata atau kuantitatif
dengan pembacaan nilai absorbansi (OD) pada ELISA plate reader (Iromo dan
Farisa 2014).
Prinsip dasar ELISA yang dipergunakan adalah prinsip dasar secara
kompetitif langsung. Analisis berlangsung dalam wadah microwell (mikroplat)
dengan konsentrasi antibodi yang dilapiskan pada mikroplat 0 mg/mL. Hormon
tiroksin yang terdapat pada contoh yang diperiksa akan berkompetisi dengan
antibodi yang berada dalam mikroplat. Bahan atau pereaksi yang tidak berikatan
akan terbuang setelah mengalami proses pencucian. Dengan menambahkan
substrat pada mikroplat akan terbentuk warna pada ikatan antara antibodi dan
enzim konjugat. Hasil analisis ditentukan dengan membaca optical density (OD)
pada ELISA reader (Iromo dan Farisa 2014).
Pada ELISA paling tidak menggunakan satu antibodi spesifik untuk antigen
tertentu. Sampel yang diduga mengandung antigen dengan jumlah yang tidak
diketahui diimobilisasi pada piring mikrotiterpolistiren sehingga antigen terserap
pada permukaan polistiren, kemudian ditambahkan sampel sehingga antigen
terikat oleh antibodi. Setelah antigen diimobilisasi, antibodi ditambahkan dan
terbentuk kopleks dengan antigen. Pada antibodi ini telah diikatkan enzim secara
kovalen atau antibodi pertama ini dideteksi oleh antibodi sekunder yang telah
mengikat enzim (Sudajadi dan Rohman, 2018).
Saat ini, ELISA banyak digunakan untuk mendeteksi patogen tanaman,
khususnya pada bahan tanaman yang di produksi secara vegetatif. Secara umum,
prosedur ELISA yang banyak digunakan dalam virologi tumbuhan adalah, ELISA
langsung, ELISA tak langsung dan ELISA penangkapan antigen atau ELISA lapis
ganda (sandwich) (Akin, 2006).
Sandwich ELISA digunakan untuk deteksi antigen sampel dengan langkah:
pada permukaan sumuran terikat sejumlah tertentu antibodi pengikat antigen.
Permukaan sumuran kemudian ditemepeli protein penghalang sehingga tidak akan
terjadi ikatan nonspesifik. Pada sumuran selanjutnya ditambahkan sampel yang
mengandung antigen yang tidak terikat pada antibodi. Antibodi spesifik
selanjutnya ditambahkan sehingga mengikat antigen (sandwich, antigen terletak
diantara dua antibodi). Antibodi sekunder yang membawa enzim sebagai antibodi
penunjuk yang ditambahkan yang kemudian berikatan dengan bagian Fc antibodi
(nonspesifik). Sumuran dicuci untuk menghilangkan antibodi pembawa enzim.
Suatu senyawa kromogen ditambahkan dan akan diubah oleh enzim menjadi
senyawa berwarna atau berfluorensensi. Absorbansi atau fluorensi atau sinyal
elektromia (misalnya, arus listrik) pada sumuran diukur untuk menentukan
keberadaan dan jumlah antigen (Sudajadi dan Rohman, 2018).
Penggunaan antibodi sekunder terkonjugasi enzim menjadi tidak perlu lagi
jika antibodi primer yang digunakan terkonjugasi enzim. Namun, penggunaan
antibodi sekunder terkonjugasi menghindari langkah yang mahal, yaitu membuat
antibodi-enzim untuk setiap antigen yang akan dideteksi. Dengan menggunakan
antibodi sekunder terkonjugasi enzim yang mengikat bagian Fc antibodi primer
maka antibodi sekunder itu dapat digunakan pada berbagai situasi. Jika tanpa
antibode pengikat sebagai lapisan pertama, berbagai protein didalam sampel,
termasuk protein serum, secara kompetitif terserap pada permukaan plastik. Hal
ini akan menurunkan jumlah antigen terimobilisasi. Penggunaan antibodi
sepesifik murni untuk mengikat antigen pada plastik menjadi tidak perlu lagi
memurnikan antigen dalam campuran kompleks sebelum pengukuran,
mempermudah tahapan uji, dan menaikan spesifisitas metode ini. Hubungan
antara jumlah antigen dan intensitas warna yang timbul pada sandwich ELISA
(Sudajadi dan Rohman, 2018).
 BAB III
METODE PENELITIAN
A. Prinsip
Prinsip dasar ELISA adalah analisis interaksi antara permukaan fase
padat dengan menggunakan konjugat antibodi atau antigen yang dilabel
enzim. Enzim ini akan bereaksi dengan substrat dan menghasilkan warna.
Warna yang timbul dapat ditentukan secara kualitatif dengan pandangan mata
atau kuantitatif dengan pembacaan nilai absorbansi (OD) pada ELISA plate
reader.
B. Pra Analitik
1. Alat
Adapun alat yang digunakan dalam praktikum kali ini yaitu:
Microsentrifuge, tabung sampel darah, ELISA washer, ELISA Reader
Multiskan GO, Tourniquet, swa alkohol, spuit 3cc, tabung
microsentrifuge, aquades.
2. Bahan
Adapun bahan yang digunakan dalam praktikum kali ini yaitu: Diluent
consentrate 5x, wash solution 20x, enzyme antibody conjugate 100x,
chromogen-substrate solution, stop solution, anti-human prealbumin
ELISA microplate, human prealbumin standard, mikropipet single channel
ukuran 100-1000 μl dan 20-200 μl serta mikropipet multichannel, tip
mikropipet, vortex, gelas ukur dan aluminium foil.
C. Analitik
1. Persiapan Sampel
a). Diambil darah masing-masing tabung sebanyak 1,5 cc sampel 1 dan 2
Dimasukan kedalam tabung EDTA (untuk plasma).
b). Diambil sampel ke 3 dan dimasukan ke dlaam tabung mikrosentrifuge
(untuk serum).
c). Disentrifuge ketiga sampel tersebut dengan kecepatan 3000 rpm selam
10 menit.
d). Diambil sampel lalu diencerkan dengan diluent solution 5x 1x
 e). Disiapkan 2 tabung eppendorf untuk setiap sampel
f). Ditambahkan 5 μl sampel dan 495 μl diluent 1x pada tabung 1,
kemudian disentrifuge
g). Ditambahkan 5 μl tabung 1 dan 495 μl diluent 1x pada tabung 2,
kemudian disentrifuge.
2. Standar
a). Disiapkan 8 tabung eppendorf
b). Dibuat standar 7 dengan menghomogenkan 8 μL Human pre-
calibrator dan 677 μL diluent 1x, lalu disentrifuge
c). Dibuat standar 6 dengan menghomogenkan 300 μL standar 7 dan 300
μL diluent 1x, lalu disentrifuge
d). Dibuat standar 5 dengan menghomogenkan 300 μL standar 6 dan 300
μL diluent 1x, lalu disentrifuge
e). Dibuat standar 4 dengan menghomogenkan 300 μL standar 5 dan 300
μL diluent 1x, lalu disentrifuge
f). Dibuat standar 3 dengan menghomogenkan 300 μL standar 4 dan 300
μL diluent 1x, lalu disentrifuge
g). Dibuat standar 2 dengan menghomogenkan 300 μL standar 3 dan 300
μL diluent 1x, lalu disentrifuge
h). Dibuat standar 1 dengan menghomogenkan 300 μL standar 2 dan 300
μL diluent 1x, lalu disentrifuge
i). Dibuat standar 0 dengan menggunakan 600 μL diluent 1x
3. Well ELISA (Anti-Human Prealbumin ELISA Microplate).
a). Dipipet standar 7-0 ke dalam well kolom 1 (A-H) sebanyak 100 μL
dengan menggunakan micropipet.
b). Dipipet sampel 1-3 kedalam well kolom 2 (A-H) sebanyak 100 μL
dengan menggunakan micropipet
c). Diinkubasi pada suhu ruangan selama 60±2 menit. Lalu tutup well
plate dengan plastik transparan dan dalam posisi sejajar.
d). Disiapkan wash solution 20x → 1x sebanyak 100 ml, dengan
menghomogenkan 5 ml wash solution dan 95 ml aquades.
e). Dicuci well plate dengan larutan was solution sebanyak 4 kali dengan
menggunakan alat ELISA washer, dilakukan setelah diinukbasi.
f). Disiapkan 100x enzyme-antibody conjugate yang diencerkan menjadi
1x, dengan menghomogenkan 20 μl enzim dan 1980 μl 1x diluent
g). Dimasukan ke masing-masing well 100 μl enzim yang telah
diencerkan. Kemudian tutup dengan aluminium foil (dalam keadaan
gelap) dan inkubasi selama 30±2 menit.
h). Dilakukan pencucian kembali seperti langkah 5.
i). Dimasukan 10 μL TMB substrate solution pada masing-masing well
dan inkubasi dengan suhu ruang dan keadaan gelap selama 10 menit.
j). Dimasukan 100 μL stop solution pada masing-masing well.
k). Masukan seluruh well ke ELISA Reader multiskan Go dan lakukan
pembacaan hasil dengan gelombang absorbansi 450 nm.
 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. HASIL (GAMBAR)
1. Hasil pengukuran standar
No Konsentrasi (pg/mL) Absorbansi
1 50 0.136
2 100 0.236
3 200 0.33
4 400 0.66
5 800 1.01
2. Kurva standar

S = 0.03460486
r = 0.99756498

1
1 .1

3
0 .9
Y Axis (u n its)

4
0 .7

6
0 .5

7
0 .3

9
0 .1

0
0 .0
0.0 146.7 293.3 440.0 586.7 733.3 880.0

X Axis (units)

3. Nilai absorbansi dan kadar IL-10 pada sampel

No Sampel Absorbansi Kadar (Pg/ml)
1 Sampel 1 0.22 109.11
2 Sampel 2 0.49 280.58
3 Sampel 3 0.601 361.88
4 Sampel 4 0.548 322.06
5 Sampel 5 0.612 370.4
 4. Plate Layout

Keterangan: Well A1: Blank, Well A2-A6 berisi Standart, Well A7-A11
adalah sampel.

B. PEMBAHASAN
ELISA adalah suatu metode yang dikerjakan sebagai sarana mengukur
kadar antigen atau antibodi dalam suatu medium cair, seperti serum atau organ
yang telah dicairkan/dilarutkan. Metode ELISA yang dilakukan dalam
praktikum ini merupakan metode untuk mengukur kadar IL-10 dalam serum
tikus. Prinsipnya adalah adanya ikatan antigen-antibodi yang akan dibaca
dengan reaksi enzimatis yang dapat mengakibatkan terjadinya perubahan
intensitas warna pada larutan. Intensitas warna ini kemudian akan diukur pada
ELISA reader.
Metode ELISA yang dipakai pada praktikum ini adalah model ELISA
Sandwich Indirect (doubel antibody). Antibodi monoklonal atau poliklonal
dapat digunakan sebagai antibodi penangkap pada tipe sandwich ELISA.
Antibodi monoklonal mempunyai monospesifitas yang memungkinkan hasil
deteksi yang baik dan perbedaaan kuantitas yang kecil pada konsentrasi
antigen. Antibodi poliklonal digunakan untuk menarik sebanyak mungkin
antigen.
Plate dilekatkan dengan antibodi, lalu dimasukkan sampel antigen
kemudian ditambah antibodi kedua terkonjugasi enzim. Jika pada sampel
terdapat antigen maka akan terjadi kompleks antibodi. Antibodi primer 1,
Antibodi primer 2, Sinyal pertama-antigen-antibodi kedua terkonjugasi enzim.
Selanjutnya, dimasukkan substrat enzim sehingga enzim akan memecah
substrat dan menghasilkan warna. Hasil positif dideteksi dengan melihat nilai
absorbansi (OD) dan secara visual. Hasil positif ini berbanding lurus yaitu
semakin banyak antigen pada sampel maka semakin banyak antibodi yang
terdeteksi dan semakin tinggi nilai optical densitinya.
Hasil absorbansi yang didapatkan pada praktikum menunjukkan bahwa
semakin besar konsentrasi maka nilai OD semakin besar (berbanding lurus).
Tabel hasil pengukuran standar dapat dibuat kurva standart dimana sumbu x
adalah konsentrasi (pg/ml) dan y adalah nilai absorbansi. Dari kurva standart
dapat diketahui nilai regresi r = 0,99756. Persamaan tersebut akan digunakan
untuk menghitung konsentrasi kadar sampel.
Pada sampel 1 didaptkan nilai absorbansi 0,22 setelah dimasukkan
persamaan kurva standar di dapatkan nilai kadar IL-10 adalah 109,117 pg/ml.
Sampel 2 nilai absorbansi 0,49 dan kadar IL-10 adalah 280,587 pg/ml. Sampel
3 nilai absorbansi 0,601 dan kadar IL-10 adalah 361,884 pg/ml. Sampel 4 nilai
absorbansi 0,548 dan kadar IL-10 adalah 322,065 pg/ml. Sampel 5 nilai
absorbansi 0,612 dan kadar IL-10 adalah 370,404 pg/ml.
 BAB V
PENUTUP
A. Kesimpulan
Disimpulkan bahwa hasil yang didapatkan pada praktikum kali ini yaitu,
Sampel 1 kadar IL 10 = 109.11 Pg/ml, Sampel 2 kadar IL 10 = 280.58 Pg/ml,
Sampel 3 kadar IL 10 = 361.88 Pg/ml, Sampel 4 kadar IL 10 = 322.06 Pg/ml,
Sampel 5 kadar IL 10 =370.4 Pg/ml.
B. Saran
Diharapkan kepada para praktikan agar menggunakan APD lengkap saat
melakukan praktikum, dan juga memperhatikan cara-cara pemipetan yang baik
dan benar agar hasil yang didaptkan sesuai dan tidak rusak.
 Daftar Pustaka
Iromo dan farizah, 2014 “Analisis Kandungan Hormon Tiroksin Dengan Metode
Elisa Pada Induk Betina Kepiting Bakau (Scylla Serrata)” Vol,7. No,1
Bunyamin dkk, 2015 “Produksi Serum Rabbit Anti-Catfish Terhadap Penyakit
Motile Aeromonas Septicemia (Mas) Pada Ikan Patin Siam (Pangasius
Hypophthalmus)” Vol,1. No,1
Sudjadi dan Roman 2018 “Analisis Derivat Babi” GMU Press : Yogyakarta
Akin 2006 “Virologi Tumbuhan” IKAPI : Yogyakarta