LAPORAN LENGKAP

ANLISIS INSTRUMEN
“SPEKTRO ELISA”

OLEH :
KELOMPOK 5

LABORATORIUM ANALISIS FARMASI DAN KIMIA

MEDISINAL
PROGRAM STUDI STRATA SATU FARMASI
SEKOLAH TINGGI ILMU FARMASI MAKASSAR
MAKASSAR
2023
 BAB I
PENDAHULUAN
I.1 Latar Belakang
Teknik Elisa merupakan salah satu dari Teknik imunologi yang bertujuan
untuk mengetahui atau mengukur kadar dari aktivitas/respon ekspresi protein dan
status reaksi imun dari reaksi individu/ respon imun. Dalam perkembangannya
teknik imunologi tidak hanya bisa dilakukan dengan metoda ELISA tetapi juga
imunohistokimia (IHC), Western blot, Amino Acid seq, FACS analysis. Pada
metoda ELISA spesimen yang biasa dipakai berupa cairan misalnya serum atau
hasil ekstraksi dalam bentuk infusa berbagai bahan. Apabila spesimen berupa
serum maka masuk dalam ranah pemeriksaan serologik yang mempelajari reaksi
antigen dan antibodi secara invitro. Pemeriksaan serologik sering dilakukan
sebagai upaya menegakkan diagnosis, walaupun saat ini pemeriksaan serologik
tidak terbatas pada penyakit infeksi, namun untuk menunjang diagnosis penyakit
infeksi memang hal yang sering dilakukan. Pengamatan secara in vitro terhadap
perubahan kompleks antigen-antibodi (Ag-Ab) sangat mungkin dapat dilakukan
dengan berbagai metode termasuk Elisa dan sangat membantu dalam menegakkan
diagnosis dan pengembangan penelitian (Dr. Budi Santosa, 2020).
ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) atau 'penetapan kadar
imunosorben dengan menggunakan antibodi sekunder berlabel enzim merupakan
uji serologis yang umum digunakan di berbagai laboratorium imunologi.
Keunggulan uji ini antara lain adalah memiliki teknik pengerjaan yang relatif
sederhana, ekonomis, dan memiliki sensitivitas yang cukup tinggi. Pada tahun
1971, Peter Perlmann dan Eva Engvall memperkenalkan teknik ELISA dalam
bidang imunologi (ELISA konvensional) yang pada waktu itu bertujuan untuk
menganalisis interaksi antigen dengan antibodi di dalam suatu sampel yang
ditandai dengan menggunakan indicator enzim sebagai pelapor/reporter
label/signal (Dr. Budi Santosa, 2020).
I.2 Maksud dan Tujuan
I.2.1 Maksud Praktikum
Adapun maksud dari praktikum ini yaitu untuk mengetahui prinsip dan cara
kerja teknik ELISA.
I.2.2 Tujuan Praktikum
Adapun tujuan dari praktikum ini yaitu :
1. Memahami prinsip kerja dan penggunaan alat spektro ELISA.
2. Mampu melakukan pemeriksaan kuantitatif dengan teknik ELISA.
I.3 Prinsip Praktikum
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
II.1 Gambaran Umum
ELISA adalah suatu teknik biokimia yang terutama digunakan dalam bidang
imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu sampel.
Jika sedang mencari antibodi maka plate ELISA di coated dengan antigen yang
sesuai demikian pula sebalikknya jika sedang mencari antigen maka plate yang
disediakan di coated dengan antibodi yang sesuai. Dalam perkembanggan
kemajuan teknologi, teknik ELISA telah banyak digunakan untuk berbagai bidang
7 baik diagnostik dalam bidang medis, patologi tumbuhan, dan juga berbagai
bidang industri. Kelebihan metoda ELISA dibandingkan dengan metoda imun
lainnya adalah penggunaan antibodi dengan spesifitas yang tinggi sehingga
akurasi bahan atau analit yang ditemukan sangat dapat diandalkan. Berdasarkan
uraian diatas maka penulis akan membahas tentang ELISA dan aplikasinya pada
infusa daun padi IR bagendit (Dr. Budi Santosa, 2020).
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah salah satu metoda
dalam bidang laboratorium terutama imunologi untuk mengetahui ekspresi
protein, reaksi imunitas, respon imun. Dalam bidang imunologi teknik ini
digunakan untuk menentukan adanya antigen atau antibodi dalam sampel/serum.
ELISA merupakan suatu teknik biokimia yang dalam perkembangannya banyak
diaplikasikan dalam berbagai bahan baik human, rat, tumbuhan dan lain lain yang
juga berfungsi sebagai alat diagnostik dalam bidang medis maupun non medis
misalnya industri. Prinsip dasar reaksi ELISA adalah mereaksikan antigen dengan
antibodi yang berlabel enzim yang kemudian ditambah dengan substrat sehingga
akan dihidrolisis menjadi presipitat warna yang dapat dideteksi menggunakan
Elisa reader. Pada tahapan akhir Teknik Elisa selalu ditambah dengan stop
solution yang berfungsi untuk menghentikan reaksi. Bahan asam kuat biasanya
digunakan sebagai larutan stop solution (Dr. Budi Santosa, 2020).
II.2 Jenis-jenis Metode ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
1. ELISA DIRECT (Dr. Budi Santosa, 2020).
Teknik ELISA direct adalah yang paling sederhana. Pada Teknik ini
biasanya untuk mengukur antige pada sampel dengan menggunakan antibodi
monoclonal yang spesifik. Antigen dari sampel yang dicari dimasukkan pada
microtiter sehingga antigen tersebut dapat menempel pada dinding microtiter.
Pada tahapan ini microtiter dibilas untuk menghilangkan antigen yang tidak
menempel pada dinding microtiter tersebut. Antibodi yang berlabel enzim
(dicoated dengan enzim misalnya dengan horse rapid peroksidase/HRP)
ditambahkan sehingga terjadi ikatan komplek antigen antibodi yang berlabel
enzim dan pencucian dilakukan pada tahapan ini untuk menghilangkan
antibodi yang tidak terikat dengan antigen yang diinginkan. Tahapan akhir
sebelum pemberian stop solution adalah dengan menambahkan substrat yang
bereaksi dengan 13 enzim yang terdapat pada antibodi sehingga akan
menghasilkan presipitat warna yang dapat diukur kadar atau keberadaan
antigen yang dicari baik menggunakan kolorimetri, chemiluminescent, atau
fluorescent end-point.
Beberapa kelemahan ELISA direct antara lain:
a. Cukup mahal
b. Kurang sensitive (penurunan imunoreaktifitas antibodi)
c. Tidak memiliki fleksibilitas enzim
Sedangkan kelebihan dari ELISA direct antara lain:
a. hanya 1 antibodi sehingg cepat
b. reaksi silang dapat dihindari
2. ELISA INDIRECT (Dr. Budi Santosa, 2020).
Pada Teknik ELISA Indirect yang dicari adalah antibodi sehingga
diperlukan antigen yang spesifik. Antigen spesifik (monoclonal), antibodi
yang dicari pada sampel, antibodi sekunder yang berlabel enzim, substrat, dan
stop solution adalah mutlak diperlukan untuk Teknik ELISA indirect ini.
 Kelemahan ELISA indirect antara lain :
a. Metoda imobilisasi antigen nya non spesifik
b. Waktu pengujian relative lama 15
Kelebihan dari ELISA indirect antara lain :
a. Banyak produk variasi antibodi sekunder.
b. Lebih sensitive
3. ELISA SANDWICH (Dr. Budi Santosa, 2020).
Teknik Elisa Sandwich mirip dengan Elisa direct yaitu mencari antigen
yang diinginkan dan yang membedakan adalah pada Elisa Sadwich, antigen
yang dicari tidak perlu dipurifikasikan. Teknik Elisa Sandwich menggunakan
antibodi primer untuk bereaksi dengan antigen yang diinginkan pada sampel
dan bereaksi dengan antibodi sekunder yang berlabel enzin. Komplek antigen
antibodi primer dan antibodi sekunder ini selanjutnya dengan penamnbahan
substrat akan menghasilkan presipitat warna dan intensitas warna ini
mencerminkan konsentrasi antibodi yang dicari pada sampel. Pada Teknik
Elisa Sandwich. Antigennya bersifat multivalent seperti polisakarida atau
protein yang memiliki minimal 2 sisi antigenik agar dapat berinteraksi dengan
antibodi primer spesifik dan antibodi sekunder spesifik yang berlabel enzim.
Antibodi primer disebut juga antibodi penangkap dan antibodi sekunder
disebut juga antibodi deteksi.
Elisa Sandwich memiliki tingkat sensitivitas yang tinggi sehingga
aplikasi Elisa Sandwich kebanyakan untuk mendeteksi keberadaan antigen
yang kadarnya rendah dengan tingkat kontaminasi pada sampel yang tinggi.
Tingkat sensitifitas Elisa Sandwich dipengaruhi oleh beberapa factor antara
lain:
a. Molekul antibodi primer banyak yang menempel pada dinding-dinding
microtiter.
b. Tingkat avinitas antibodi primer dan antibodi sekunder dengan antigen
yang dicari
c. Pengembangan dari Elisa direct.
 Kelebihan teknik ini adalah:
a. Kemampuan mendeteksi antigen dengan titer yang sangat rendah karena
bisa bereaksi dengan antibodi primer dan antibodi sekunder dengan
sangat baik.
b. Kemampuan mengukur antigen multivalent(yang tidak perlu
dipurifikasikan) dan mampu mengikat antigen yang diinginkan secara
selektif.
Kelemahan Teknik ini adalah:
a. Sulit mencari dua sisi antibodi yang dapat bereaksi dengan antigen yang
sama pada sisi antigenik yang berbeda (epitope yang berbeda)
b. Hanya dapat diaplikasikan untuk mendeteksi keberadaan antigen
multivalent pada sampel
4. ELISA COMPETITIVE (Dr. Budi Santosa, 2020).
Teknik ELISA Competitive merupakan pengembangan Teknik Elisa yang
berguna untuk menguji keberadaan antigen atau antibodi. Prinsip kerja Teknik
ini adalah dengan menambahkan competitor untuk bereaksi dengan antigen
atau antibodi yang terjadi pada microtiter.
Teknik Elisa Comptetitive memiliki tingkat sensitivitas tinggi akibat
spesifisitas dari antibodi dan antigen. Oleh karena itu kelebihan dari teknik ini
adalah larutan sampel yang mengandung antibodi atau antigen tidak perlu
dipurifikasikan atau dimurnikan.
II.3 Prinsip Kerja
Microplate atau microtiter dilekati dengan antibodi atau antigen yang dicari
(prinsip ini adalah untuk direck Elisa). Penempelan tersebut dapat dilakukan
secara non spesifik maupun spesifik. Jika menggunakan indirect Elisa maka pada
dinding microtiter dilekati dengan antibodi spesifik dan jika Sandwich Elisa maka
pada dinding microtiter dilekati dengan antibodi spesifik. Langkah selanjutnya
adalah mereaksikan dengan antigen atau antibodi yang dicari pada sampel dan
antibodi yang berlabel enzim. Penambahan substrat selalu dilakukan setelah
penambahan andibodi yang berlabel enzim agar terjadi presipitat warna dan
reaksinya dihentikan
dengan penambahan stop solution. Kadarnya dibaca pada alat Elisa reader atau
spektrofometer (Dr. Budi Santosa, 2020).
II.4 Hubungan ELISA Reader dengan Kefarmasian
ELISA adalah salah satu metoda dalam bidang laboratorium terutama
imunologi untuk mengetahui ekspresi protein, reaksi imunitas, respon imun.
Dalam bidang imunologi teknik ini digunakan untuk menentukan adanya antigen
atau antibodi dalam sampel/serum. ELISA merupakan suatu teknik biokimia yang
dalam perkembangannya banyak diaplikasikan dalam berbagai bahan baik human,
rat, tumbuhan dan lain lain yang juga berfungsi sebagai alat diagnostik dalam
bidang medis maupun non medis misalnya industri (Dr. Budi Santosa, 2020).
II.5 Paracetamol/Asetaminophen
Parasetamol merupakan obat analgesik non narkotik dengan cara kerja
menghambat sintesis prostaglandin terutama di sistem syaraf pusat (SSP).
Analgesik adalah senyawa yang dalam dosis terapeutik meringankan atau
menekan rasa nyeri, tanpa memiliki kerja anestesi umum. Efek antiinflamasi
sangat lemah. Diabsorpsi cepat dan sempurna melalui saluran cerna. Memiliki
konsentrasi tertinggi dalam plasma antara 1-3 jam (Dimas dkk, 2019).
II.6 Metanol
Metanol digunakan sebagai pelarut karena berdasarkan farmakope edisi VI
yaitu paracetamol/asetaminophen larut dalam air mendidih dan dalam natrium
hidroksida; mudah larut dalam etanol, metanol, dimetil formamida, aseton dan
asetat (Dirjen POM, 2020).
II.7 Uraian Bahan
1. Aquadest (Dirjen POM, FI VI 2020)
Nama resmi : AQUA DESTILATA
Nama lain : Air suling
RM/BM : H2O/18,02

Rumus struktur :
 Kelarutan : Larut dalam etanol gliter
Pemerian : Cairan jernih tidak berwarna
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik
Kegunaan : Sebagai pelarut
2. Metanol (Dirjen POM FI VI, 2020)
Nama resmi : METHANOL
Nama lain : Metanol
RM/BM : CH3OH/32

Rumus struktur :
Kelarutan : Dapat bercampur dengan air membentuk cairan
jernih tidak berwarna
Pemerian : Cairan tidak berwarna, jernih, bau khas
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik
Kegunaan : Sebagai pelarut
3. Parasetamol (Dirjen POM FI VI, 2020)
Nama resmi :ACETAMINOPHENUM
Nama lain : Paracetamol/Asetaminophen
RM/BM : C8H9NO2/151,16

Rumus struktur :
Kelarutan : Larut dalam 70 bagian air, dalam 7bagian etanol
(95%) P, dalam 13bagian aseton P, dalam 40
bagiangliserol P dan dalam 9 bagianpropilenglikol
P; larut dalam larutanalkali hidroksida
Pemerian : Serbuk hablur, putih, tidak berwarna, rasa sedikit
pahit
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik, terlindung dari cahaya
Kegunaan : Analgetikum;Antipiretikum
 BAB III
METODE KERJA
III.1 Alat dan Bahan
III.1.1 Alat
Adapun alat yang digunakan yaitu microplate, micropipet, vial, pipet
tetes, timbangan analitik, spektro elisa, kertas saring, dan labu ukur.
III.1.2 Bahan
Adapun bahan yang digunakan yaitu paracetamol/asetaminophen,
metanol, dan aquadest.
III.2 Cara Kerja
III.2.1 Pembuatan Kurva Standar
1. Dibuat larutan dengan konsentrasi 100 ppm dalam 50 ml dengan 5 mg
sampel.
2. Dibuat pengenceran dari larutan konsentrasi 100 ppm menjadi
konsentrasi 10 ppm dalam 25 ml.
3. Dibuat pengenceran dari larutan konsentrasi 10 ppm menjadi
konsentrasi 2,4,6,8,10 ppm masing-masing dalam 5 ml.
III.2.2 Pembuatan Larutan Sampel
1. Dibuat larutan dengan konsentrasi 400 ppm dalam 25 ml dengan
menggunakan sampel.
2. Dibuat pengenceran dari larutan konsentrasi 400 ppm menjadi 6 ppm
dalam 10 ml.
3. Dimasukkan larutan konsentrasi 6 ppm kedalam vial sebanyak 5 ml.
 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
IV.1 Hasil Pengamatan
a) Kelompok 1 dan 4
Konsentrasi Absorbansi
1 2 3
2 ppm 3,589 3,522 3,581
4 ppm 3,582 3,585 3,585
6 ppm 3,597 3,591 3,602
8 ppm 3,597 3,513 3,597
10 ppm 3,586 3,623 3,618
Sampel 3,619 3,603 3,608
Blanko 3,599 3,602 3,586

b) Kelompok 2 dan 5
Konsentrasi Absorbansi
1 2 3
2 ppm 3,599 3,597 3,606
4 ppm 3,577 3,596 3,589
6 ppm 3,639 3,628 3,645
8 ppm 3,636 3,625 3,645
10 ppm 3,597 3,591 3,593
Sampel 3,583 3,580 3,581
Blanko 3,580 3,581 3,588
 c) Kelompok 3 dan 6
Konsentrasi Absorbansi
1 2 3
2 ppm 3,571 3,578 3,580
4 ppm 3,572 3,569 3,561
6 ppm 3,572 3,580 3,579
8 ppm 3,589 3,582 3,582
10 ppm 3,580 3,572 3,576
Sampel 3,569 3,584 3,54
Blanko 3,54 3,579 3,588

IV.2 Pembahasan