ELISA

SANDWICH DAN
KOMPETITIF
Dosen Pengampu : Nurminha, M.Sc.
Kelompok 6
1. M r i y a n r a h m a d a n 2013353014
2. M a r i t a M o t i k s e p t i w 2013353016
3. N a b e l a h i d a y a t u n n i s a 2013353017
4. N a z l a d i v a m a h a r a n i 2013353019
5. N e l a m a s r u r o t u l r o h m a 2013353020
6. N o v a l i a k e n c a n a 2013353021
7. N u r H a s a n a h 2013353022
8. N u r m e g a a r a s w a t i 2013353023
9. O c t a v i a n a 2013353024
10. P u t r i a y u l e s t a r i 2013353025
01
Pengertian ELISA
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
adalah salah satu metoda dalam bidang imunologi
untuk mengetahui ekspresi protein, reaksi imunitas,
respon imun. Teknik ini digunakan untuk
menentukan adanya antigen atau antibodi dalam
sampel/serum.

ELISA juga suatu teknik biokimia yang

dikembangankan berbagai bahan baik human, rat,
tumbuhan dan lain lain yang juga berfungsi sebagai
alat diagnostik dalam bidang medis maupun non
medis misalnya industri.
 PRINSIP ELISA
Sejumlah antigen yang tidak dikenal ditempelkan pada
suatu permukaan, kemudian antibodi spesifik dicucikan
pada permukaan, kemudian antibodi spesifik pada suatu
permukaan tersebut, sehingga akan berikatan dengan
antigennya. Antibodi ini terikat dengan suatu enzim, dan
pada tahap terakhir, ditambahkan substansi yang dapat
diubah oleh enzim menjadi sinyal yang dapat dideteksi.

Dalam ELISA fluoresensi, saat cahaya dengan panjang

gelombang tertentu disinarkan pada suatu sampel,
kompleks antigen/antibodi akan berfluoresensi sehingga
jumlah antigen pada sampel dapat disimpulkan
berdasarkan besarnya fluoresensi.
 JENIS – JENIS METODE ELISA
Secara garis besar ada dua jenis Teknik ELISA yaitu
kompetetitif dan non kompetitif. Teknik kompetitif
menggunakan konjugat antibodi-enzim atau antigen -
enzim. Teknik non kompetitif menggunakan antibodi
primer dan sekunder. Antibodi sekunder pada Teknik
nonkompetitif dikonjugasikan dengan anzim yang
berfungsi sebagai signal. Seiring dengan kebutuhan deteksi
antigen atau antibodi secara secara sensitif dan spesifik,
maka Teknik ELISA telah banyak digunakan. Inovasi
Teknik ELISA telah berkembang pesat yang tujuannya
adalah untuk mendapatkan hasil yang optimal. contoh
inovasi teknik ELISA yaitu:
− ELISA Direct
− ELISA Indirect
− ELISA Sandwich
Teknik ELISA dibedakan menjadi dua jenis,
yaitu:

1.Teknik ELISA kompetitif yang menggunakan konjugat antigen-

enzim atau konjugat antibodi-enzim.
2.Teknik ELISA non kompetitif yang menggunakan dua antibodi
(primer dan sekunder) Pada teknik ELISA non kompetitif, antibody
kedua (sekunder) akan dikonjugasikan dengan enzim yang
berfungsi sebagai signal. Teknik ELISA non kompetitif ini
seringkali disebut sebagai teknik ELISA sandwich.
1.Elisa Kompetitif

Antigen yang diberi label enzym dicampur dengan bahan

pemeriksaan yang juga mengandung antigen yang sama dan akan
ditentukan, sehingga terjadi kompetisi dalam mengikat sejumlah
yang terbatas . antibodi spesifik yang terikat pada fase Antigen yang
terikat kemudian dipisahkan dari yang bebas dengan pencucian, dan
aktivitas enzim ditentukan dengan penambahan substrat. Dengan
menggunakan suatu kurva baku yang didapat dari larutan-Iarutan
baku yang mengandung berbagai konsentrasi antigen yang
diketahui,dapat ditentukan kadar antigen dalam bahan pemeriksaan.
Aktivitas dari enzim yang terikat berbanding terbalik dengan kadar
antigen yang terdapat dalam bahan pemeriksaan.
 2.Non kompetitif

Teknik ELISA non kompetitif yaitu yang menggunakan dua antibodi

(primer dan sekunder). Pada teknik ELISA nonkompetitif, antibodi
kedua (sekunder) akan dikonjugasikan dengan enzim yang berfungsi
sebagai signal. Teknik ELISA non kompetitif ini seringkali disebut
sebagai teknik ELISA sandwich.

• Dalam pengaplikasiannya, ELISA sandwich lebih banyak dimanfaatkan

untuk mendeteksi keberadaan antigen multivalent yang kadarnya sangat
rendah pada suatu larutan dengan tingkat kontaminasi tinggi. Hal ini
disebabkan ELISA sandwich memiliki tingkat sensitivitas tinggi terhadap
antigen yang diinginkan akibat keharusan dari antigen tersebut untuk
berinteraksi dengan kedua antibodi
• larutan antigen elisa sandwich yang diinginkan tidak perlu
dipurifikasi. Namun, karena antigen yang diinginkan tersebut harus
dapat berinteraksi dengan antibodi primer spesifik dan antibodi
sekunder spesifik tertaut enzim signal, maka teknik ELISA sandwich
ini cenderung dikhususkan pada antigen memiliki minimal 2 sisi
antigenic (sisi interaksi dengan antibodi) atau antigen yang bersifat
multivalent seperti polisakarida atau protein. Pada ELISA sandwich,
antibodi primer seringkali disebut sebagai antibodi penangkap,
sedangkan antibodi sekunder seringkali disebut sebagai antibodi
deteksi.
ELISA SANDWICH
ELISA SANDWICH
Teknik Elisa Sandwich mirip dengan Elisa direct yaitu mencari antigen yang
diinginkan dan yang membedakan adalah pada Elisa Sadwich, antigen yang
dicari tidak perlu dipurifikasikan. Teknik Elisa Sandwich menggunakan
antibodi primer untuk bereaksi dengan antigen yang diinginkan pada sampel
dan bereaksi dengan antibodi sekunder yang berlabel enzin. Komplek
antigen antibodi primer dan antibodi sekunder ini selanjutnya dengan
penamnbahan substrat akan menghasilkan presipitat warna dan intensitas
warna ini mencerminkan konsentrasi antibodi yang dicari pada sampel. Pada
Teknik Elisa Sandwich. Antigennya bersifat multivalent seperti polisakarida
atau protein yang memiliki minimal 2 sisi antigenik agar dapat berinteraksi
dengan antibodi primer spesifik dan antibodi sekunder spesifik yang
berlabel enzim. Antibodi primer disebut juga antibodi penangkap dan
antibodi sekunder disebut juga antibodi deteksi.
Mekanisme pemeriksaan Antigen
dengan ELISA metode Sandwich
Mekanisme pemeriksaan Antibodi dengan ELISA
metode Kompetitif
 Prosedur Kerja Metode Elisa Sandwich:

1. Semua reagen, larutan standart dan contoh disiapkan sesuai

intruksi.
2. Disiapkan pengenceran standart dan wash buffer.
3. Ditambahkan 50 µl control/spesimen ke masing-masing well plate.
4. Ditambahkan 50 µl conjugate pada masing-masing well kecuali
blangko.
5. Diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37 °C (well ditutup dengan
sealer).
6. Sealer dibuka, dan well dicuci sebanyak 5 kali dengan wash
buffer.
7. Ditambahkan 50µl Substrate Solution A dan 50 µl
Substrate Solution B ke masing-masing well.
8. Dinkubasi selama 10 menit pada suhu 37°C.
9. Ditambahkan 50µl stop solution ke masing-masing well
(warna biru akan berubah menjadi kuning).
10. Ditentukan Optical Density (OD), dan dibaca dengan Elisa
Reader pada panjang gelombang 450 nm, dalam 30 menit
setelah penambahan Stop Solution.
 Prosedur Kerja Metode Elisa competitive

1. Pada microtiter diisi dengan antibodi spesifik

2. Antigen spesifik dengan antibodi spesifik yang berlabel enzim
dan sampel yang mengandung antigen ditambahkan dalam
microtiter.
3. Lakukan pencucian untuk membuang sisa antigen spesifik
maupun antibodi yang berlabel enzim yang tidak berikatan
dengan antigen pada sampel yang tidak berikatan dengan
antibodi spesifik.
4. Lalu tambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan antibodi
berlabel enzim dan angtigen spesifik yang dapat menghasilkan
presipitat warna yang intensitasnya merupakan cerminan dari
kadar antigen pada sampel.
5. Sebelum pembacaan pada Elisa reader maupun
spektrofotometer perlu ditambah asam pekat sebagai stop
solution yang berfungsi untuk menghentikan reaksi.
Interpretasi Hasil

ELISA Sandwich :
1. Semakin tinggi kadarnya warnanya semakin pekat
2. Semakin rendah kadarnya warnanya semakin samar/jernih
tidak pekat
ELISA Competitive :
3. Semakin tinggi kadarnya warnanya semakin jernih/samar
tidak pekat
4. Semakin rendah kadarnya semakin pekat warnanya
 ELISA SANDWICH

Tingkat sensitifitas Elisa Sandwich dipengaruhi

oleh beberapa factor antara lain:
● Molekul antibodi primer banyak yang
menempel pada dinding-dinding microtiter.
● Tingkat avinitas antibodi primer dan antibodi
sekunder dengan antigen yang dicari
● Pengembangan dari Elisa direct.
 Kegunaan Alat ELISA Washer
• ELISA washer adalah instrumen laboratorium yang
dirancang untuk mengontrol prosedur pencucian (wash)
sampel yang diteliti yang disusun dalam format berbasis
pelat maupun strip.
• Tahap wash pada proses ELISA memiliki dua pilihan
pengerjaan yaitu secara manual maupun menggunakan
mesin.
• Penggunaan mesin, dibandingkan dengan manual,
memiliki beberapa keuntungan seperti waktu pengerjaan
lebih ringkas, menghindari kontaminasi dan human
error, serta lebih presisi sehingga menghindari
terbuangnya reagen.
 Kegunaan Alat ELISA Reader
ELISA reader adalah alat untuk membaca plate
ELISA untuk menentukan konsentrasi antigen atau
antibodi yang terkandung dalam sampel.

Prinsip kerja ELISA reader dengan mendeteksi sinyal cahaya yang

dihasilkan oleh sampel yang telah dipipet ke dalam microplate. Sifat optik
sampel ini adalah hasil dari reaksi biologis, kimiawi, biokimia atau fisika.
Reaksi analitik yang berbeda menghasilkan perubahan optik yang berbeda
yang digunakan untuk analisis selanjutnya.
 KELEBIHAN & KEKURANGAN
ELISA SANDWICH

KELEBIHAN :
KEKURANGAN :
 Kemampuan mendeteksi antigen dengan titer
 Sulit mencari dua sisi antibodi yang dapat
yang sangat rendah karena bisa bereaksi dengan
bereaksi dengan antigen yang sama pada sisi
antibodi primer dan antibodi sekunder dengan
antigenik yang berbeda (epitope yang berbeda)
sangat baik.
 Hanya dapat diaplikasikan untuk mendeteksi
 Kemampuan mengukur antigen multivalent(yang
keberadaan antigen multivalent pada sampel.
tidak perlu dipurifikasikan) dan mampu
mengikat antigen yang diinginkan secara
selektif.
 Dapat menurunkan kuantitas antigen yang
terimobilisasi.
 Kelebihan dan kekurangan ELISA
Kompetitif

Kelebihan dari teknik ELISA kompetitif Kelemahan elisa kompetitif

adalah tidak diperlukannya purifikasi terhadap adalah semakin tinggi konsentrasi antigen
larutan sampel yang mengandung antibody atau baru,semakin lemah sinyal
antigen yang diinginkan, tapi hasil yang diperoleh yang dihasilkan.
tetap memiliki tingkat sensitivitas tinggi akibat
sifat spesitifitas dari antibody dan antigen.
Thanks

CREDITS: This presentation template was created by

Slidesgo, including icons by Flaticon, and infographics
& images by Freepik.