Biomed broo

Pada pelatihan penelitian ini secara garis besar langkah-langkah ELISA sudah
dilakukan dengan teratur dan semua peserta telah mengetahui dasar teori dan
prosedur dari ELISA ini, namun didapatkan ketidak akuratan pada hasil standart IL-
6, hal tersebut dikarenakan pipetting yang tidak konsisten, karena pipetting
dilakukan oleh oleh masing-masing peserta pelatihan. Masing-masing peserta
memiliki keakuratan yang berbeda dalam pipetting sehingga mungkin terdapat
kesalahan pipetting oleh sebagian peserta. Selain itu pada saat washing dengan
cara menghentakkan plate ELISA gengan tegas, kekuatan dari para peserta
pelatihan juga berbeda, sehingga kemungkinan peserta yang memiliki kekuatan
lebih, secara tidak sengaja terlalu kuat saat menghentakkan dan sebagian ikatan
antigen-antibodi yang telah ter-coating dapat terlepas dan terbuang. Oleh karena itu
metode ELISA seharusnya dilakukan oleh 1 orang saja sehingga keakuratan dan
kekuatan dalam melaksanakan langkah-langkah ELISA akan stabil.
Karena tidak dapat diperoleh standart IL-6 yang akurat, maka untuk
melanjutkan pelatihan yaitu cara menghitung kadar IL-6 dari sampel, maka
diambilah standart dari sampel lain (uPAR) yang memiliki tingkat keakuratan tinggi.
Seharusnya standart yang digunakan adalah standart yang di-running bersama
dengan sampel pada saat yang bersamaan. Meskipun zat yang diukur sama, kita
tidak boleh menggunakan standart suatu zat dari ELISA sebelumnya untuk
digunakan pada ELISA yang sedang di-running, apalagi menggunakan standart zat
yang berbeda. Namun tujuan utama ELISA ini adalah sebagai pelatihan sehingga
lebih mementingkan pada cara dan prosedur yang dilakukan saat ELISA termasuk
cara menghitung kadar suatu zat. Dengan menggunakan standart uPAR, hasil
absorbansi IL-6 dapat dimasukkan ke dalam persamaan kurva standart uPAR
sehingga dapat diketahui kadar Il-6 pada masing-masing sampel.
Untuk menghitung kadar dari IL-6 digunakan cara regresi linier, sama dengan
cara yang digunakan untuk elektroforesis, namun persamaan garis yang dipakai
pada standart adalah persamaan logaritma. Persamaan garis yang dipakai ada
bermacam macam, tergantung dari kit yang kita gunakan atau dengan pendekatan
hubungan titik-titik hasil spectrophotometri menjadi sebuah persamaan garis.
Pertama, absorbansi atau optical density IL-6 hasil spectrophotometri dibuat pada
tabel pada Ms. Exel. Selanjutnya dibuat logaritma dari data absorbansi tersebut dan
dibuat logaritma dari konsentrasi standart. Kemudian dibuatlah persamaan garis
terhadap Log absorbansi dan Log konsentrasi dengan sumbu X sebagai Log
konsentrasi dan sumbu Y sebagai Log absorbansi. Absorbansi dari sampel
selanjutnya juga dibuat logaritmanya. Dengan persamaan garis tersebut, dapat
dihitung dan diketahui logaritma konsentrasi dari IL-6. Berikutnya dibuat anti-
logaritma dari Log konsentrasi IL-6 yang sudah didapatkan, sehingga akan diketahui
konsentrasi IL-6. Namun konsentrasi IL-6 ini adalah konsentrasi dalam pengenceran
25 kali, sehingga untuk mengetahui konsentrasi IL-6 sesungguhnya dalam sampel,
konsentrasi yang telah kita dapat ini dikali 25. Dari perhitungan regresi linier tersebut
dapat diketahui konsentrasi IL-6 pada masing-masing sampel.
6) Diukur di spektofotometer pada (panjang gelombang) 540 nm Blangko : Aquades (sebagai titik
nol) Standart : memakai standart BSA 7) Absorbansi yang diperoleh dimasukkan ke rumus excel
sehingga diperoleh penyamaan y=ax + b, dimana : Y= absorbansi X= konsentrasi x Fp (Faktor
pengencer) 975 PBS + 25 sampel = = 40 x 2.2 Pemeriksaan ELIZA (Enzyme-Linked Immunosorbent
Assay)

Antibodi sekunder : Antibodi yang biasanya melekat/dilekatkan pada antibodi primer.Biasanya

digunakan dalam praktik ELISA

Jenis2 ELISA

DIRECT ELISA

Metode langsung pelabelan terhadap antibodi target itu sendiri.  Microwell plates dicoated
dengan target antigen  dan ikatan dari antibodi diukur dengan colorimetric,
chemiluminescent, atau fluorescent end-point.

Kelebihannya Cepat dan Cross Reaksi dengan antibodi sekunder tidak ada. Kekurangannya
Pelabelan antibodi primer mahal, Tidak ada fleksibilitas pemilihan antibodi primer, Sinyal 
amplifikasinya sedikit

INDIRECT ELISA

Metode dua  langkah  : antibodi sekunder berlabel untuk deteksi. Kemudian antibodi primer
diinkubasi dengan antigen. Dan inkubasi kedua dengan antibodi sekunder berlabel yang dapat
mengenali antibodi primer.

Antibodi yang digunakan :

Monoklonal antibodi yang spesifik pada satu site di permukaan partikel molekul tertentu dan
Poliklonal antibodi yang kurang spesifik (harus mempunyai  afinitas yang tinggi terhadap
antigen)

Kelebihannya Antibodi berlabel telah banyak tersedia dan bervariasi, Sensitivitas meningkat
karena setiap antibodi primer mengandung beberapa epitop yang dapat terikat oleh antibodi
sekunder berlabel, meningkatkan sinyal amplifikasi. Kekurangannya Waktu lama (inkubasi)
dan Cross reaksi terjadi dari antibodi sekunder.

SANDWICH ELISA

Sandwich ELISA mengukur jumlah antigen antara dua lapisan antibodi. Antigen yang akan
diukur harus berisi setidaknya dua antigenic sites dan mampu mengikat antibodi (protein atau
polisakarida misal deteksi species pada daging).
Biasanya digunakan untuk antigen dengan konsentrasi rendah. Capture antibody  dimurnikan
dan terikat dengan permukaan plate well. Antigen ditambahkan kemudian membentuk
komplek  antibodi. Produk yang tidak terikat akan tercuci saat washing. Antibodi berlabel 
yang kedua mengikat antigen dan antibodi. Uji ini  mengukur jumlah antibodi kedua berlabel
yang terikat matriks (antigen), melalui penggunaan substrat kolorimetri.

Keuntungan utama antigen tidak perlu dimurnikan sebelum digunakan, namun tes ini  sangat
spesifik. Kelemahannya tidak semua antibodi dapat digunakan.

COMPETITIVE ELISA

ELISA ini mempunyai hubungan terbalik antara sinyal yang diperoleh dan konsentrasi analit
dalam sampel, karena persaingan antara analit bebas dan konjugat ligan-enzim untuk
antibodi  yang dicoating.

Kelebihannya Antibodi primer tidak perlu dimurnikan, Antigen dianggap sebagai pesaing,
Analit yang tinggi dalam sampel ditandai dengan sinyal yang rendah (warna dari substrat
semakin rendah).

MULTIPLEX ELISA

Dengan mengembangkan target antigen dengan coating atau capture antibodi atau antibodi
array lebih dari satu dalam satu hole mikroplate.

Sampel berupa plasma, cell lysate, atau tissue extract, dengan metode  direct, indirect,
sandwich atau competitive, labeling atau non-labeling, tergantung dari teknologi antibody
array.