BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Definisi ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu teknik

biokimia yang terutama digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi

kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu sampel. ELISA telah digunakan

sebagai alat diagnostik dalam bidang medis, patologi tumbuhan, dan juga berbagai

bidang industri. Dalam pengertian sederhana, sejumlah antigen yang tidak dikenal

ditempelkan pada suatu permukaan, kemudian antibodi spesifik dicucikan pada

permukaan tersebut, sehingga akan berikatan dengan antigennya. Antibodi ini

terikat dengan suatu enzim, dan pada tahap terakhir, ditambahkan substansi yang

dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal yang dapat dideteksi. Dalam ELISA

fluoresensi, saat cahaya dengan panjang gelombang tertentu disinarkan pada suatu

sampel, kompleks antigen/antibodi akan berfluoresensi sehingga jumlah antigen

pada sampel dapat disimpulkan berdasarkan besarnya fluoresensi.

Penggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifitas

untuk antigen tertentu. Sampel dengan jumlah antigen yang tidak diketahui

diimobilisasi pada suatu permukaan solid (biasanya berupa lempeng mikrotiter

polistirene), baik yang non-spesifik (melalui penyerapan pada permukaan) atau

spesifik (melalui penangkapan oleh antibodi lain yang spesifik untuk antigen yang

sama, disebut ‘sandwich’ ELISA). Setelah antigen diimobilisasi, antibodi

pendeteksi ditambahkan, membentuk kompleks dengan antigen. Antibodi

pendeteksi dapat berikatan juga dengan enzim, atau dapat dideteksi secara
 langsung oleh antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim melalui

biokonjugasi. Di antara tiap tahap, plate harus dicuci dengan larutan deterjen

lembut untuk membuang kelebihan protein atau antibodi yang tidak terikat.

Setelah tahap pencucian terakhir, dalam plate ditambahkan substrat enzimatik

untuk memproduksi sinyal yang visibel, yang menunjukkan kuantitas antigen

dalam sampel. Teknik ELISA yang lama menggunakan substrat kromogenik,

meskipun metode-metode terbaru mengembangkan substrat fluorogenik yang jauh

lebih sensitif.

2.2 Prinsip Pemeriksaan ELISA

Prinsip dasar dari teknik ELISA ini secara simple dapat dijabarkan

sebagai berikut:

Pertama antigen atau antibodi yang hendak diuji ditempelkan pada suatu

permukaan yang berupa microtiter. Penempelan tersebut dapat dilakukan melalui

dua cara, yaitu penempelan secara non spesifik dengan adsorbs ke permukaan
 microtiter, dan penempelan secara spesifik dengan menggunakan antibody atau

antigen lain yang bersifat spesifik dengan antigen atau antibodi yang diuji (cara ini

digunakan pada teknik ELISA sandwich). Selanjutnya antibodi atau antigen

spesifik yang telah ditautkan dengan suatu enzim signal (disesuaikan dengan

sampel => bila sampel berupa antigen, maka digunakan antibodi spesifik,

sedangkan bila sampel berupa antibodi, maka digunakan antigen spesifik)

dicampurkan ke atas permukaan tersebut, sehingga dapat terjadi interaksi antara

antibodi dengan antigen yang bersesuaian. Kemudian ke atas permukaan tersebut

dicampurkan suatau substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal. Pada saat

substrat tersebut dicampurkan ke permukaan, enzim yang bertaut dengan antibodi

atau antigen spesifik yang berinteraksi dengan antibodi atau antigen sampel akan

bereaksi dengan substrat dan menimbulkan suatu signal yang dapat dideteksi.

2.3 Jenis-Jenis Metode ELISA Untuk Mendeteksi Antigen

2.3.1 ELISA Direct

Teknik ELISA ini merupakan teknik ELISA yang paling sederhana. Teknik

ini seringkali digunakan untuk mendeteksi dan mengukur konsentrasi antigen

pada sampel. ELISA Direct menggunakan suatu antibody spesifik

(monoklonal) untuk mendetaksi keberadaan antigen yang diinginkan pada

sampel yang diuji.

A. Kelemahan ELISA Direct

1. Immunoreaktifitas antibodi kemungkinan akan berkurang akibat

bertaut dengan enzim.

 2. Penautan enzim signal ke setiap antibodi menghabiskan waktu dan

mahal.

3. Tidak memiliki fleksibilitas dalam pemilihan tautan enzim (label) dari

antibodi pada percobaan yang berbeda.

4. Amplifikasi signal hanya sedikit.

5. Larutan yang mengandung antigen yang diinginkan harus dimurnikan

6. sebelum digunakan untuk uji ELISA direct.

C. Kelebihan ELISA Direct

1. Metodologi yang cepat karena hanya menggunakan 1 jenis antibody.

2. Kemungkinan terjadinya kegagalan dalam uji ELISA akibat reaksi

silang dengan antibody lain (antibody sekunder) dapat diminimalisasi.

2.4.2 ELISA Sandwich

Teknik ELISA jenis ini menggunakan antibody primer spesifik untuk

menangkap antigen yang diinginkan dan antibody sekunder tertaut enzim

signal untuk mendeteksi keberadaan antigen yang diinginkan.

Pada dasarnya prinsip kerja dari ELISA sandwich mirip dengan ELISA

direct, hanya saja pada ELISA sandwich larutan antigen yang diinginkan tidak

perlu dipurifikasi. Namun, karena antigen yang diinginkan tersebut harus

dapat berinteraksi dengan antibody primer spesifik dan antibody sekunder

spesifik tertaut enzim signal, maka teknik ELISA sandwich ini cenderung

dikhususkan pada antigen memiliki minimal 2 sisi antigenic (sisi interaksi

dengan antibodi) atau antigen yang bersifat multivalent seperti polisakarida

atau protein. Pada ELISA sandwich, antibody primer seringkali disebut

sebagai antibody penangkap, sedangkan antibody sekunder seringkali disebut

sebagai antibody penangkap, sedangkan antibody sekunder seringkali disebut

sebagai antibody deteksi.

Dalam pengaplikasiannya, ELISA sandwich lebih banyak dimanfaatkan

untuk mendeteksi keberadaan antigen multivalent yang kadarnya sangat

rendah pada suatu larutan dengan tingkat kontaminasi tinggi. Hal ini

disebabkan ELISA sandwich memiliki tingkat sensitivitas tinggi terhadap

antigen yang diinginkan akibat keharusan dari antigen tersebut untuk

berinteraksi dengan kedua antibody.

Dalam ELISA sandwich, terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi

tingkat sensitivitas dari hasil pengujian, antara lain :

1) Banyak molekul antibody penangkap yang berhasil menempel pada

dinding-dinding microtiter.

2) Avinitas dari antibody penangkap dan antibody detector terhadap antigen

sebenarnya, teknik ELISA sandwich ini merupakan pengembangan dari

teknik ELISA terdahulu, yaitu ELISA direct.

A. Kelebihan Teknik ELISA Sandwich

Pada dasarnya berada pada tingkat sensitivitasnya yang relatif lebih

tinggi karena antigen yang diinginkan harus dapat berinteraksi dengan

dua jenis antibody, yaitu antibody penangkap dan antibody detector,

kemampuannya menguji sampel yang tidak murni dan mampu mengikat

secara selektif antigen yang dikehendaki. Tanpa lapisan pertama

antibodi penangkap, semua jenis protein pada sampel (termasuk protein

 serum) dapat diserap secara kompetitif oleh permukaan lempeng,

menurunkan kuantitas antigen yang terimobilisasi.

B. Kelemahan Teknik ELISA Sandwich

Namun demikian, teknik ELISA sandwich ini juga memiliki

kelemahan, yaitu teknik ini hanya dapat diaplikasikan untuk medeteksi

antigen yang bersifat multivalent serta sulitnya mencari dua jenis

antibody yang dapat berinteraksi antigen yang sama pada sisi antigenic

yang berbeda (epitopnya harus berbeda).

2.4 Alat dan Bahan

2.4.1 Bahan

Bahan-bahan yang digunakan pada metode ELISA yang terdapat didalam

Kit ELISA terdiri dari:

1. Plate ELISA yang telah dilapisi (coated) dengan antibodi atau antigen

2. Antigen yang dimurnikan (jika sampel yang hendak dideteksi atau

dikuantifikasi berupa antibodi).

3. Antibodi yang dimurnikan (jika sampel yang hendak dideteksi atau

dikuantifikasi berupa antigen).

4. Larutan standard (kontrol positif dan negatif).

5. Sampel yang ingin dites.

6. standar antibiotik

7. Konjugate atau enzim penanda

8. Substrat yang bersifat spesifik terhadap enzim signal

9. Larutan pencuci ( Buffer )

 10. Larutan penghenti reaksi (stop solution)

2.4.2 Peralatan

Alat-alat yang digunakan pada pemeriksaan metode ELISA antara lain

yaitu:

1. Timbangan

2. Gelas ukur

3. Single mikro pipet 5-50 µl, 50-1000 µl

4. Multi channel mikro pipet 5-50 µl, 50-300 µl

5. Bak reservoar

6. Homogenizer/stomacher/mortar,

7. Sentrifuger atau filter

8. Penangas air

9. Inkubator

10. ELISA Plate washer atau labu semprot

11. ELISA Plate Reader dengan filter panjang gelombang 400-600 nm untuk

pengukuran kuantitatif

12. Komputer

2.4 Proseder Kerja

Berikut ini merupakan prosedur kerja dari pemeriksaan ELISA yang digunakan

untuk mendeteksi antigen:

 2.4.1 ELISA Direct

1. Microtiter diisi dengan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan,

sehingga antigen tersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding

lubang microtiter.

2. Microtiter dibilas untuk membuang antigen yang tidak menempel pda

dinding lubang microtiter.

3. Antibodi yang telah ditautkan dengan enzim signal dimasukkan ke dalam

lubang lubang microtiter sehingga dapat berinteraksi dengan antigen

yang diinginkan, yang dilanjutkan dengan membilas microtiter untuk

membuang antibody tertaut enzim signl yang tidak berinteraksi dengan

antigen.

4. Tambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal ke dalam

lubang-lubang microtiter tersebut, sehingga enzim yang tertaut dengan

antibodi yang telah berinteraksi dengan antigen yang diinginkan akan

berinteraksi dengan substrat dan menimbulkan signal dapat dideteksi.

5. Pendeteksian interaksi antara antibodi dengan antigen tersebut

selanjutnya dapat dihitung dengan menggunakan kolorimetri,

chemiluminescent, atau fluorescent end-point.

2.4.2 ELISA Sandwich

Tahapan dalam Sandwich ELISA adalah sebagai berikut:

1. Disiapkan permukaan untuk mengikatkan antibodi ‘penangkap’

2. Semua non spesifik binding sites pada permukaan diblokir

3. Sampel berisi antigen dimasukkan dalam plate

4. Plate dicuci untuk membuang kelebihan antigen yang tidak terikat

5. Antibodi primer ditambahkan, supaya berikatan secara spesifik dengan

antigen

6. Antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim dimasukkan, yang akan

berikatan dengan antibodi primer.

7. Plate dicuci, sehingga konjugat antibodi-enzim yang tidak terikat dapat

dibuang.

8. Ditambahkan reagen yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal

berwarna/ berfluoresensi/ elektrokimia.

9. Diukur absorbansinya untuk menetukan kehadiran dan kuantitas dari

antigen
 DAFTAR PUSTAKA

Brahmana K. 1981. Immunologi, Serologi dan Tata Kerja Laboratorium. Medan.

Suryo. 1996. Genetika. Departemen P dan K Direktorat Jendral Pendidikan
Tinggi. Jakarta.

Haussmann, M. F., C. M. Vleck, and E. S. Farrar. 2007. A laboratory exercise

toillustrate increased salivary cortisol in response to three stressful
conditionsusing competitive ELISA. Adv. Physiol. Educ. 31: 110– 115.

Leng, S. J. McElhaney, J. Walston, D. Xie, N. Fedarko, G. Kuchel. 2008. "Elisa and

Multiplex Technologies for Cytokine Measurement in Inflammation and Aging
Research". J Gerontol a Biol Sci Med Sci 63 (8):879–884.PMC 2562869.PMID
18772478.

Lequin, RM. 2005. "Enzyme Immunoassay (EIA)/Enzyme-Linked Immunosorbent

Assay (ELISA)" Clinical Chemistry 51 (12): 2415 – 2418. Setiawan, I Made. 2007.
Pemeriksaan Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)untuk diagnosis
Leptospirosis. EBERS PAPYRUS