Definisi Elisa
teknik biokimia yang digunakan pada imunologi
a. Direct Elisa
b. Indirct Elisa
c. Sandwich Elisa
Elisa
mendeteksi keberadaan antigen atau antibodi yang terimobilisasi dalam sumur
menggunakan antigen atau antibodi spesifik yang terkonjugasi dengan enzim (Murphy,
12012).
2
antigen atau antibodi target
ditandai dengan terjadinya kompleks antigen dan antibodi
reaksi enzimatik. yang terbentuk mengubah
warna substrat yang
ditambahkan kedalam sumur
menjadi produk
4 3
Perubahan warna tersebut yang Proses enzimatik tersebut akan
akan dikuantifikasi menggunakan mengakibatkan terjadinya
spektrofotometer atau ELISA perubahan warna.
reader
Macam Teknik ELISA
Jenis
Direct Elisa
untuk mendeteksi dan mengukur konsentrasi suatu antigen. Antigen yang akan dideteksi akan berikatan langsung
(direct) dengan antibodi detector (antibodi yang telah dilabeli oleh enzim reporter). Antibodi yang digunakan pada
teknik direct ELISA berjumlah satu buah.
INDIRECT
untuk mendeteksi dan mengukur konsentrasi antigen atau antibodi. Teknik tersebut memiliki karakteristik yaitu
antigen tidak menempel langsung pada antibodi detector (indirect). Antigen akan berikatan dengan antibodi lain
terlebih dahulu. Antibodi tersebut kemudian akan berikatan dengan antibodi yang telah dilabeli.
SANDWICH
menggunakan dua antibodi yaitu antibodi penangkap dan antibodi yang dilabeli enzim. Antigen yang telah berikatan
dengan antobodi penangkap akan berikatan kembali dengan antibodi yang dilabeli enzim. Sandwich indirect ELISA
menggunakan tiga antibodi yaitu antibodi penangkap, antibodi detektor, dan anti-antibodi yang dilabeli enzim. Antigen
yang telah berikatan dengan antibodi penangkap akan berikatan dengan antibodi detektor dan anti-antibodi yang
dilabeli enzim (Crowther 1995: 39)
No Jenis Elisa Kekurangan Kelebihan
1 Direct Elisa cepat dan tidak terdapat reaksi silang harga pelabelan antibodi primer yang mahal,
dengan antibodi sekunder. tidak ada fleksibilitas pemilihan antibodi primer,
dan sinyal amplifikasinya sedikit (Walker & Rapley
2008: 668).
2 Indirect Elisa memiliki sensitivitas tinggi dan sinyal indirect ELISA yaitu membutuhkan waktu yang
amplifikasi yang tinggi.Kekurangan lama dan terjadi cross reaksi terjadi (Walker &
Rapley 2008: 669).Enzim bertindak sebagai
amplifier, bahkan jika hanya sedikit antibodi
terikat enzim yang tetap terikat, molekul enzim
akan memproduksi berbagai molekul sinyal.
3 Sandwich Elisa kemampuannya menguji sampel yang tidak
murni, dan mampu mengikat secara
selektif antigen yang dikehendaki. Tanpa
lapisan pertama antibodi penangkap,
semua jenis protein pada sampel
(termasuk protein serum) dapat diserap
secara kompetitif oleh permukaan
lempeng, menurunkan kuantitas antigen
yang terimobilisasi.
4 Kompetitif Elisa sampel yang kurang murni dapat sensitivitas dan spesifisitas menurun
digunakan.
Komponen Elisa
Sebagai konjugat : enzim dilabel pada
Untuk pembedaan yang terkait dengan
antigen atau antibodi.
yang bebas. Bahan : selulosa, kaca, atau
FASE ENZIM Syaat enzim: tidak memengaruhi
plastik. Plastik banyak digunakan karena
PADAT interaksi antigen-antibodi, senstitif tes
protein (antibodi/antigen) mudah
deteksinya, kemurniannya tinggi, dan
melekat di permukaan plastik.
stabil dalam penyimpanan.
1 2 3 4
Jenis antibodi yang dapat Harga antibodi monoklonal Dapat terjadi kesalahan Reaksi antara enzim signal
digunakan hanya jenis relatif lebih mahal daripada pengujian akibat kontrol negatif dan substrat berlangsung
yang menunjukkan respons
antibodi monoklonal antibodi poliklonal. relatif cepat, sehingga
positif yang disebabkan
(antibodi yang hanya pembacaan harus dilakukan
inefektivitas dari larutan
mengenali satu antigen). dengan cepat.
blocking sehingga antibodi
sekunder dapat berinteraksi
dengan antibodi bertaut enzim
signal dan menimbulkan signal.
Hal yang Perlu
Diperhatikan
1. Pemipetan
Tip baru untuk setiap sampel
dan reagen
Presisi volume dari tip harus
bagus
Tip jangan menyentuh pinggir
atau dasar sumur
2. Pencucian
Cuci menurut petunjuk dalam
prosedur
Pastikan buffer pencuci baru
Jangan menyentuh permukaan
dalam dari sumur
Sumur sumur jangan sampai
kering
Hal yang Perlu
Diperhatikan
3. Inkubasi
Temperatur dan lama inkubasi
harus tepat
Plate dan stripnya harus ditutup 5. Pembacaan
untuk menghindari penguapan
Pastikan bahwa ukuran filter
sudah benar
Pastikan dibuat blanko
4. Pengenceran Hindarkan adanya titik-titik air
bekas jari, dan debu pada plate
Sampel diencerkan dengan
buffer yang cocok
Sampel dan bahan kontrol harus
di homogenkan dengan baik
dan benar sebelum dipakai
Pengendalian Mutu
Pemeriksaan dengan
Teknik ELISA
Pra Pasca
analitik Analitik Analiti
k
Dengue IgG
HBsAg
Prinsip HBsAg
Direct
Tes HBsAg berdasarkan pada antigen
direk teknik ELISA menggunakan
microwell yang dilapisi dengan antibody
monoklonal (tikus, mab).
Sampel bereaksi secara serentak dengan
melumpuhkan mab dan dengan antibody
anti-HBs poliklonal (Pig guinea)
mengalami konjugasi dengan enzim
horseradish peroksidase.
Nama Keterangan
Reagen MIC Strip mikrotiter dilapisi antibodi monoklonal Anti-HBs (mouse)
&
NC HbsAg kontrol negatif (serum manusia)
Kompone
nnya PC HbsAg kontrol positif (serum manusia)
CON Enzim konjugasi Anti-HBs (marmut) Horse Radish Peroksidase
WS Larutan cuci
SA Substrat reagen A (buffer asam asetat)
SB Substrat reagen B (TetraMetilBenzidin)
STOP Stop solution (asam sulfat)
Pasca Analitik
Perhitungan Cut
Validasi Hasil
Off
• MNC = Abs sampel (B1+C1+D1)/3
• MPC = Abs sampel (E1+F1)/2 • A1 Blanko < 0,100
• COV = MNC + 0,025 • MNC < 0,100
• Cut-off value COV = MNC + 0,025 • MPC ≥ 0,600
• MPC – MNC ≥ 0,50
Anti
HBsAg
Prinsip Anti HBsAg
Perhitungan Cut
Validasi Hasil
Off
• MNC = Abs sampel (B1+C1+D1)/3
• MPC = Abs sampel (E1+F1)/2 • A1 < 0,1
• COV = MNC + 0,025 • MNC < 0,2
• Cut-off value COV = MNC + 0,025 • MPC > 0,5
• MPC –MNC ≥ 0,3
• Nilai NC harus dalam( 0,5 X
MNC ) – (2,0 X MNC)
• COV = MNC + 0,025
Interpretasi Hasil
+ + + Kronis
- - + Virus bereplikasi
- + - Pasca vaksin
Rubella
IgG
Prinsip Rubella IgG
WS Washing Solution
Perhitungan Cut
Validasi Hasil
Off
• MNC = Abs sampel (B1+C1)/2
• MCC = Abs sampel (D1+E1)/2 • A1 Blanko < 0,150
• MPC = Abs sampel (F1+G1)/2 • MNC ≤ MCC
• MPC ≥ 0,750
• MPC : MNC ≥ 2,5
Interpretasi Hasil
WS Washing Solution
Perhitungan Cut
Validasi Hasil
Off
Hitung nilai rata-rata NC di B1 dan C1 Blanko substrat (A1) < 0,100
(MNC). MNC ≤ 0,300
MNC : A450 (B1) + A450 (C1) A450 Positif Kontrol ≥ COV
2
Nilai Cut-Off (COV) = MNC + 0,35
Interpretasi Hasil
Perhitungan Cut
Validasi Hasil
Off
Nilai
rata-rata dari Negative Control Blanko substrat (A1) < 0,150
(MNC), Cut-off Control (MCC), dan MNC ≤ MCC
Positive Control Low, Positive Control MPCM ≥ 0,750
Medium, Positive Control High (MPCL,
MPCM : MNC ≥ 5
MPCM, MPCH) dihitung berdasarkan
contoh berikut:
Interpretasi Hasil
Reagen MIC Strip mikrotiter yang spesifik terhadap anti human IgM
& NC kontrol negatif (serum manusia)
Kompone PC kontrol positif (serum manusia)
nnya CC Cut-Off Control (serum manusia)
DIL-G Buffer fosfat
CON Konjugat antigen toxoplasma, Horseradish Peroxidase
WS Larutan cuci
SUB Substrat tetrametilbenzidine
STOP Stop solution (asam sulfat)
Pasca Analitik
Perhitungan Cut
Validasi Hasil
Off
MNC <0,150
MCC> 0,200
MPC/COV≥ 2,0
Cut Off Value Blanko ≤ 0,100
(COV) = MCC
Interpretasi Hasil
Anti-HIV
Prinsip Anti-HIV
Perhitungan Cut
Validasi Hasil
Off
MNC ≤ 0,1
MNC :
MPC ≥ 1,5
MPC :
Nilai value ( COV ) = MNC + 0,1
Interpretasi Hasil
Hasil Interpretasi
A450 (specimen) < COV x 0,9 anti-HIV ½ ab-nonreactive