http://pandalikespurple.blogspot.co.id/2012/04/test-elisa.

html

SEJARAH ELISA

Sebelum pengembangan ELISA, satu-satunya pilihan untuk melakukan suatuimmunoassay adalah

radioimmunoassay, teknik menggunakan antigen berlabel radioaktif atau antibodi. Dalam
radioimmunoassay, radioaktivitas memberikan sinyal, yang menunjukkanapakah suatu antigen
tertentu atau antibodi hadir dalam sampel. Radioimmunoassay pertama kali dijelaskan dalam kertas
oleh Rosalyn Sussman Yalow dan Salomo Berson diterbitkan pada tahun 1960. Sebuah mikrobiologi
menggunakan enzim suatu Linked tes Assay (ELISA)immunosorbent, dalam rangka untuk
mengembangkan metode untuk deteksi cepat antigen p24 HIV dalam sampel darah.

Karena radioaktivitas menimbulkan ancaman kesehatan potensial, alternatif yang lebih aman itu
dicari. Sebuah alternatif yang cocok untuk radioimmunoassay akan mengganti sinyalnon-radioaktif di
tempat sinyal radioaktif. Ketika enzim (seperti peroksidase) bereaksi dengansubstrat yang sesuai
(seperti ABTS atau 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine), perubahan warna terjadi, yang digunakan sebagai
sinyal. Namun, sinyal tersebut harus dikaitkan dengankeberadaan antibodi atau antigen, yang
mengapa enzim harus dihubungkan dengan antibodiyang sesuai. Proses menghubungkan secara
independen dikembangkan oleh Stratis Avrameasdan GB Pierce. Karena itu perlu untuk
menghilangkan antibodi atau antigen terikat dengan mencuci, antibodi atau antigen harus tetap ke
permukaan wadah;. Yaitu, immunosorbent telahharus dipersiapkan. Sebuah teknik untuk mencapai
hal ini diterbitkan oleh Wide dan JerkerPorath pada tahun 1966.

Pada tahun 1971, Petrus Perlmann dan Eva Engvall di Universitas Stockholm di Swedia,dan Anton
Schuurs dan Bauke van Weemen di Belanda mandiri makalah yang disintesispengetahuan ini ke
dalam metode untuk melakukan EIA / ELISA.

Pengertian ELISA

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu teknik biokimia yang terutama
digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu
sampel. ELISA telah digunakan sebagai alat diagnostik dalam bidang medis, patologi tumbuhan, dan
juga berbagai bidang industri. Dalam pengertian sederhana, sejumlah antigen yang tidak dikenal
ditempelkan pada suatu permukaan, kemudian antibodi spesifik dicucikan pada permukaan tersebut,
sehingga akan berikatan dengan antigennya. Antibodi ini terikat dengan suatu enzim, dan pada tahap
terakhir, ditambahkan substansi yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal yang dapat dideteksi.
Dalam ELISA fluoresensi, saat cahaya dengan panjang gelombang tertentu disinarkan pada suatu
sampel, kompleks antigen/antibodi akan berfluoresensi sehingga jumlah antigen pada sampel dapat
disimpulkan berdasarkan besarnya fluoresensi.

Penggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifitas untuk antigen tertentu.
Sampel dengan jumlah antigen yang tidak diketahui diimobilisasi pada suatu permukaan solid
(biasanya berupa lempeng mikrotiter polistirene), baik yang non-spesifik (melalui penyerapan pada
permukaan) atau spesifik (melalui penangkapan oleh antibodi lain yang spesifik untuk antigen yang
sama, disebut sandwich ELISA). Setelah antigen diimobilisasi, antibodi pendeteksi ditambahkan,
membentuk kompleks dengan antigen. Antibodi pendeteksi dapat berikatan juga dengan enzim, atau
dapat dideteksi secara langsung oleh antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim melalui
biokonjugasi. Di antara tiap tahap, plate harus dicuci dengan larutan deterjen lembut untuk membuang
kelebihan protein atau antibodi yang tidak terikat. Setelah tahap pencucian terakhir, dalam plate
ditambahkan substrat enzimatik untuk memproduksi sinyal yang visibel, yang menunjukkan kuantitas
antigen dalam sampel. Teknik ELISA yang lama menggunakan substrat kromogenik, meskipun
metode-metode terbaru mengembangkan substrat fluorogenik yang jauh lebih sensitif.

Aplikasi ELISA

ELISA dapat mengevaluasi kehadiran antigen dan antibodi dalam suatu sampel, karenanya
merupakan metode yang sangat berguna untuk mendeterminasi konsentrasi antibodi dalam serum
(seperti dalam tes HIV), dan juga untuk mendeteksi kehadiran antigen. Metode ini juga bisa
diaplikasikan dalam industri makanan untuk mendeteksi allergen potensial dalam makanan seperti
susu, kacang, walnut, almond, dan telur. ELISA juga dapat digunakan dalam bidang toksikologi
untuk uji pendugaan cepat pada berbagai kelas obat.

ELISA adalah tes skrining dahulu banyak digunakan untuk HIV karena kepekaan tinggi. Dalam
ELISA, serum seseorang diencerkan 400 kali lipat dan diterapkan pada pelat yang antigen HIV yang
terpasang. Jika antibodi terhadap HIV hadir dalam serum, mereka dapat mengikat antigen HIV. Pelat
ini kemudian dicuci untuk menghapus semua komponen lain dari serum. Sebuah "antibodi sekunder"
khusus disiapkan - antibodi yang mengikat antibodi lain - kemudian diterapkan ke piring, mencuci
diikuti oleh yang lain. Ini antibodi sekunder secara kimiawi terkait di muka untuk enzim.

"Anti IgG manusia" Antibodi Ganda Sandwich ELISA

Dengan demikian, piring akan berisi enzim sebanding dengan jumlah antibodi sekunder terikat ke
piring. Sebuah substrat untuk enzim diterapkan, dan katalisis oleh enzim mengarah ke perubahan pada
warna atau fluoresensi. Hasil ELISA dilaporkan sebagai nomor; aspek paling kontroversial dari tes ini
adalah menentukan "cut-off" titik antara positif dan hasil negatif.Sebuah titik cut-off dapat ditentukan
dengan membandingkannya dengan standar yang dikenal. Jika tes ELISA digunakan untuk skrining
obat di tempat kerja, konsentrasi cut-off, 50 ng / mL, misalnya, didirikan, dan sampel yang berisi
konsentrasi analit standar akan disiapkan. Diketahui bahwa menghasilkan sinyal yang lebih kuat
daripada sampel dikenal adalah "positif." Merekayang menghasilkan sinyal lemah, yang "negatif."
Dokter Dennis E Bidwell dan Alister Voller menciptakan tes.

Kegunaan lain dari ELISA meliputi:

1. deteksi antibodi mikobakteri dalam TB.

2. deteksi rotavirus dalam tinja.

3. deteksi penanda hepatitis B dalam serum.

4. deteksi enterotoksin E. coli dalam tinja.

Tipe-tipe ELISA

Ada beberapa tipe-tipe ELISA, diantaranya adalah sebagai berikut:

1. Indirect ELISA
2. Sandwich ELISA

3. Competitive ELISA

1. Indirect ELISA

(Gambar Mekanisme Indirect ELISA)

Tahap umum yang digunakan dalam indirect ELISA untuk mendeterminasi konsentrasi antibodi
dalam serum adalah:

a) Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya ditempelkan pada permukaan
lubang plate mikrotiter. Antigen tersebut akan menempel pada permukaan plastik dengan cara
adsorpsi. Sampel dari konsentrasi antigen yang diketahui ini akan menetapkan kurva standar yang
digunakan untuk mengkalkulasi konsentrasi antigen dari suatu sampel yang akan diuji.

b) Suatu larutan pekat dari protein non-interacting, seperti bovine serum albumin (BSA) atau
kasein, ditambahkan dalam semua lubang plate mikrotiter. Tahap ini dikenal sebagai blocking,
karena protein serum memblok adsorpsi non-spesifik dari protein lain ke plate.

c) Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi dengan sampel serum dari
antigen yang tidak diketahui, dilarutkan dalam buffer yang sama dengan yang digunakan untuk
antigen standar. Karena imobilisasi antigen dalam tahap ini terjadi karena adsorpsi non-spesifik, maka
konsentrasi protein total harus sama dengan antigen standar.

d) Plate dicuci, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang diuji dimasukkan dalam
lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen terimobilisasi pada permukaan lubang, bukan pada
protein serum yang lain atau protein yang terbloking.
e) Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi, ditambahkan dalam
lubang. Antibodi sekunder ini akan berkonjugasi menjadi enzim dengan substrat spesifik. Tahap ini
bisa dilewati jika antibodi pendeteksi berkonjugasi dengan enzim.

f) Plate dicuci untuk membuang kelebihan konjugat enzim-antibodi yang tidak terikat.

g) Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh enzim untuk mendapatkan sinyal kromogenik/
fluorogenik/ elektrokimia.

h) Hasil dikuantifikasi dengan spektrofotometer, spektrofluorometer atau alat optik/ elektrokimia

lainnya.

Enzim bertindak sebagai amplifier, bahkan jika hanya sedikit antibodi terikat enzim yang tetap terikat,
molekul enzim akan memproduksi berbagai molekul sinyal. Kerugian utama dari metode indirect
ELISA adalah metode imobilisasi antigennya non-spesifik, sehingga setiap protein pada sampel akan
menempel pada lubang plate mikrotiter, sehingga konsentrasi analit yang kecil dalam sampel harus
berkompetisi dengan protein serum lain saat pengikatan pada permukaan lubang.

2. Sandwich ELISA

Tahapan dalam Sandwich ELISA adalah sebagai berikut:

a) Disiapkan permukaan untuk mengikatkan antibodi penangkap

b) Semua non spesifik binding sites pada permukaan diblokir

c) Sampel berisi antigen dimasukkan dalam plate

d) Plate dicuci untuk membuang kelebihan antigen yang tidak terikat

e) Antibodi primer ditambahkan, supaya berikatan secara spesifik dengan antigen

f) Antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim dimasukkan, yang akan berikatan dengan
antibodi primer

g) Plate dicuci, sehingga konjugat antibodi-enzim yang tidak terikat dapat dibuang

h) Ditambahkan reagen yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal berwarna/ berfluoresensi/
elektrokimia

i) Diukur absorbansinya untuk menetukan kehadiran dan kuantitas dari antigen

Keuntungan utama dari metode sandwich ELISA adalah kemampuannya menguji sampel yang tidak
murni, dan mampu mengikat secara selektif antigen yang dikehendaki. Tanpa lapisan pertama
antibodi penangkap, semua jenis protein pada sampel (termasuk protein serum) dapat diserap secara
kompetitif oleh permukaan lempeng, menurunkan kuantitas antigen yang terimobilisasi.

Prinsip kerja sandwich ELISA dapat dilihat pada skema berikut ini:

3. Competitive ELISA

Tahapan pengerjaan ELISA kompetitif berbeda dari dua metode yang telah dibahas sebelumnya,
yaitu:

a) Antibodi yang tidak berlabel diinkubasi dengan kehadiran antigennya

b) Komplek antigen-antibodi ini selanjutnya ditambahkan pada lubang yang telah dilapisi antigen

c) Plate dicuci, sehingga kelebihan antibodi tercuci (semakin banyak antigen dalam sampel,
semakin sedikit antibodi yang dapat terikat pada antigen yang menempel pada permukaan lubang,
karena inilah disebut kompetisi

d) Ditambahkan antibodi sekunder yang spesifik utnuk antibodi primer. Antibodi sekunder ini
berpasangan dengan enzim

e) Substrat ditambahkan, enzim akan mengubah substrat menjadi sinyal kromogenik/ fluoresensi.

Dalam ELISA kompetitif, semakin tinggi konsentrasi antigen orisinal, semakin lemah sinyal yang
dihasilkan. Prinsip kerjanya dapat dilihat pada gambar berikut ini:
Secara singkat tahapan kerja dalam metode ELISA dapat digambarkan sebagai berikut:
 4. Beberapa dan Portable ELISA (M & P ELISA) (ELISA Reverse di makalah yang diterbitkan)

Sebuah teknik baru (EP 1 499 894 B1 di EPO Buletin 25.02.209 N. 2009/09; USPTO 7510687 di
USPTO Buletin 2009/03/31; ZL 03.810.029,0 di SIPO RRC Buletin 2009/08/04) menggunakan fase
padat terdiri dari polistiren immunosorbent batang dengan 8-12 ogives menonjol. Seluruh perangkat
direndam dalam tabung reaksi berisi sampel dikumpulkan dan langkah-langkah berikut (cuci, inkubasi
dalam conjugate dan inkubasi dalam chromogenous) dilakukan oleh mencelupkan ogives di
microwells standar microplates pra-diisi dengan reagen.

Keuntungan dari teknik ini adalah sebagai berikut:

 Para ogives masing-masing dapat peka terhadap reagen yang berbeda, memungkinkan deteksi
simultan dari antibodi yang berbeda dan / atau antigen yang berbeda untuk multi-target tes;

Volume sampel dapat ditingkatkan untuk meningkatkan sensitivitas tes di klinik (darah, air liur,
urin), makanan (susu curah, telur dikumpulkan) dan (air) lingkungan sampel;

Satu ogive yang tersisa unsensitized untuk mengukur reaksi non-spesifik sampel;

Penggunaan perlengkapan laboratorium untuk mengeluarkan alikuot sampel, mencuci solusi dan
reagen dalam microwells tidak diperlukan, memfasilitasi pengembangan siap menggunakan
laboratorium-kit dan di tempat kit.

5. Material Dalam Metode ELISA

Antigen

Monoclonal Ab

Microplate

Blocking Buffer

Serum sample

Conjugate (secondary Ab + Enzyme)

Subtrate

Stop Sol.
 ELISA atau singkatan dari Enzyme-linked Immunosorbent Assay
merupakan jenis immunoassay (uji imun) yang telah digunakan
secara luas. ELISA merupakan rapid test atau uji cepat dalam mendeteksi
atau mengkuantifikasi jumlah antibodi atau antigen melawan virus,
bakteri, atau bahan lain. ELISA dinamakan demikian karena memang
melibatkan penggunaan enzim dan immunosorbent.

Metode ELISA untuk mengukur reaksi Antigen (Ag)

Antibodi(Ab) meningkat penggunaannya dalam pendeteksian antigen
(dari agen infeksius) atau antibodi karena metodenya yang sederhana tapi
sensitif. Sensitivitasnya sama dengan radioimmunoassay (RIA) dan hanya
membutuhkan kuantitas mikroliter untuk penggunaan reagen ujinya.
Sekarang ELISA telah diterapkan secara luas dalam deteksi berbagai
antibodi dan antigen seperti hormon, toksin, dan virus.
Beberapa keuntungan khususnya:

1. Tes ELISA memiliki sensitivitas dan spesifitas yang tinggi

2. Hasil kuantitatif ELISA dapat dibaca secara visual
3. Sejumlah tes dapat dilakukan sekaligus : ELISA telah didesain secara
spesifik untuk men-screen (baca cepat, read) sejumlah besar spesimen
sekali waktu, menjadikannya cocok untuk digunakan dalam pengawasan
dan sentralisasi pelayanan transfusi darah
4. Reagen yang digunakan untuk ELISA stabil dan dapat didistribusikan ke
laboratorium distrik lain atau daerah lain tetapi ELISA membutuhkan
teknisi yang terampil serta alat yang mahal untuk menjalankan tesnya,
penggunaannya terbatas hanya untuk kebutuhan tertentu.

Bahan yang dibutuhkan:

1. Pipet, sistem pencuci (washer system), pembaca plat ELISA: Pembaca,

pencuci,d an pipet tersedia baik manual maupun otomatis. Satu dari
faktor-faktor utama yang mempengaruhi seleksi alat adalah jumlah dan
tipe sampel yang dijalankan.
a. Pembaca ELISA: membutuhkan filter yang sesuai (650 nm dan 450 nm).
b. Pipet.
c. Sistem pencuci: dapat manual yang mencuci atau membersihkan satu baris
(row) atau kolom sekali waktu atau dapat semi-otomatis yang akan
 mencuci satu strip atau plat sekali waktu atau otomatis yang dapat
memproses multipel plat.
2. Reagen yang dibutuhkan untuk uji/tes termasuk dalam kit-nya (Coated
plates, Sample diluents, Controls, Wash Concentrate, Conjugate,
Substrate, Stop solution)

Prinsip:

Sebagian besar metode ELISA dikembangkan untuk deteksi antigen atau

antibodi terdiri dari antibodi atau antigen yang cocok dengan yang dicari,
yang kemudian dibentuk dalam fase solid, seperti permukaan plastik dari
plat polivinil atau tube polistirene, di dalamnya sumuran yang dalam dari
microdilution (cairan sejumlah mikro) atau di bagian luar dari plastik sferis
atau bead (mirip seperti kelereng kecil) yang terbuat dari logam. Sistem
tersebut dinamakan Solid Phase Immonusrbent Assay.
Sistem Enzim terdiri dari:

1. Enzim: horse radish peroxidase, alkaline phosphatase yang dilabeli atau

dihubungkan dengan antibodi spesifik.
2. Substrat spesifik:
O-Phenyl-diamine-dihydrochloride untuk peroxidase
P Nitrophenyl Phosphate- for Alkaline Phosphatase
yang ditambahkan setelah reaksi antigen-antibodi. Enzim akan
mengkatalisis substrat sehingga akan menunjukkan warna titik akhir reaksi
(senyawa kuning untuk alkaline fosfatase). Intensitas warna memberikan
indikasi jumlah ikatan antibodi atau antigen.
WATCH THE ELISA VIDEO
ELISA yang sering digunakan adalah:

a. ELISA untuk deteksi Antigen

1. Direct ELISA
2. Indirect ELISA
b. ELISA untuk deteksi Antibodi

1. Non Competitive ELISA

2. Competitive ELISA
c. Capture ELISA

https://blueskypharmacy.wordpress.com/2015/06/08/uji-elisa-prinsip-bahan-yang-dibutuhkan-
prosedur-dan-hasil/

http://microbeonline.com/elisa-test-for-antigenantibody-detection/

Competitive ELISA: Basic Principles

The central event of competitive ELISA is a competitive binding process executed by original
antigen (sample antigen) and add-in antigen. The procedures of competitive ELISA are different in
some respects compared with Indirect ELISA, Sandwich ELISA and Direct ELISA. A simplized
procedure list is as follow:
1. Primary antibody (unlabeled) is incubated with sample antigen.

2. Antibody-antigen complexes are then added to 96-well plates which are pre-coated with the
same antigen.

3. Unbound antibody is removed by washing the plate. (The more antigen in the sample, the
less antibody will be able to bind to the antigen in the well, hence "competition.")

4. The secondary antibody that is specific to the primary antibody and conjugated with an
enzyme is added.

5. A substrate is added, and remaining enzymes elicit a chromogenic or fluorescent signal.

For competitive ELISA, the higher the sample antigen concentration, the weaker the eventual
signal. The major advantage of a competitive ELISA is the ability to use crude or impure samples
and still selectively bind any antigen that may be present.
(Note that some competitive ELISA kits include enzyme-linked antigen rather than enzyme-linked
antibody. The labeled antigen competes for primary antibody binding sites with your sample
antigen (unlabeled). The more antigen in the sample the less labeled antigen is retained in the well
and the weaker the signal).
It is common that the antigen is not first positioned in the well.
Competitive ELISA advantages:
High specificity, since two antibodies are used the antigen/analyte is specifically captured and
detected

Suitable for complex samples, since the antigen does not require purification prior to
measurement

Flexibility and sensitivity, since both direct and indirect detection methods can be used

ELISA Kompetitif: Prinsip Dasar

ELISA kompetitif adalah proses pengikatan kompetitif yang dilakukan oleh antigen asli (antigen
sampel) dan antigen tambahan. Prosedur ELISA kompetitif berbeda dalam beberapa hal dibandingkan
dengan ELISA Tidak Langsung, ELISA Sandwich dan ELISA Langsung. Daftar prosedur yang
disederhanakan adalah sebagai berikut:

a. Antibodi primer (tidak berlabel) diinkubasi dengan antigen sampel.

b. Kompleks antibodi-antigen kemudian ditambahkan ke piring 96-well yang dilapisi
dengan antigen yang sama.
c. Antibodi yang tidak terikat dikeluarkan dengan mencuci piring. (Semakin banyak
antigen dalam sampel, semakin sedikit antibodi yang bisa mengikat antigen di dalam
sumur, maka "persaingan.")
d. Antibodi sekunder yang spesifik untuk antibodi primer dan dikonjugasi dengan enzim
ditambahkan.
e. Substrat ditambahkan, dan enzim yang tersisa menghasilkan sinyal kromogenik atau
fluoresen.

Untuk ELISA yang kompetitif, semakin tinggi konsentrasi antigen sampel, semakin lemah sinyal
akhirnya. Keuntungan utama ELISA yang kompetitif adalah kemampuan untuk menggunakan sampel
mentah atau tidak murni dan masih secara selektif mengikat antigen apapun yang mungkin ada.

(Perhatikan bahwa beberapa kit ELISA yang kompetitif mencakup antigen terkait enzim daripada
antibodi terkait enzim Antigen berlabel bersaing untuk situs pengikatan antibodi primer dengan
antigen sampel Anda (tidak berlabel). Semakin banyak antigen pada sampel, antigen berlabel kurang
dipertahankan pada baik dan lemahnya sinyal).

Adalah umum bahwa antigen tidak diposisikan pertama di dalam sumur.

Keunggulan ELISA yang kompetitif:

1. Spesifisitas yang tinggi, karena dua antibodi digunakan antigen / analit secara khusus
ditangkap dan dideteksi
2. Cocok untuk sampel yang kompleks, karena antigen tidak memerlukan pemurnian sebelum
pengukuran
3. Fleksibilitas dan sensitivitas, karena metode deteksi langsung dan tidak langsung dapat
digunakan

http://www.elisa-antibody.com/ELISA-Introduction/ELISA-types/competitive-elisa