IMMUNOFLUORESENSI

KELOMPOK 12
 Dini Marifa Anggraini (13341008)
 Heriyansyah (13341012)
 Intan Cahmi Florentina (13341017)
 Kanty Puspita Dewi (13341020)
 Maharani Rafika Tirta (13341023)
 Mahrifa Gita Aulia (13341024)
 Nofia Junita (13341028)
 Rina Ismaya (13341031)
 Terstia Aphrodite Mardhatillah (13341036)
PENGERTIAN IMMUNOFLUORESENSI

 Imunofluoresen adalah metode imunologi untuk

mendeteksi antibodi dari berbagai kelas
immunoglobulin dalam serum, cairan ludah, cairan
otak dengan cara mereaksikan antibody dan antigen
spesifik dan anti-antibodi yang dilabel denagan
Fluoresence Isothiocyanat (FITC), sehingga
terpancar sinar warna hijau atau merah jika di label
denganRodhamin.
SEJARAH
 Fluorescent Antibody Technique (FAT) untuk
penggunaan pertama kali oleh Coons, at all pada tahun
1942. sebelumnya telah diperkenalkan penandaan
protein antibodi dengan zat warna yang dapat
berfluoresensi. Fluoresensi merupakan pemancaran sinar
oleh atom atau molekul setelah terlebih dahulu disinari.
Zat warna yang dapat befluoesensi disebut fluorokrom.
 Tes ini  mulai diperkenalkan sejak tahun 1962 dalam
bidang pemeriksaan parasitologi dengan memakai
tekhnik indirect fluorescent antibody test.
  Sejarah penemuan teknik imunofluoresensi ini pertamakali dimulai
oleh Coons dkk.(Amerika Serikat, 1942) yang menggungakan
imunofluoresensi untuk mendeteksikeberadaan antigen di potongan
jaringan beku. Burnham (Amerika Serikat, 1963) melaporkan
deposit granular dari IgG dan C3 di dermoepidermal junction
pada pasienlupus eritematosus. Di tahun 1964, Beutner dan Jordon
(AmerikaSerikat)
menggunakan pemeriksaan imunofluoresensi indirek untuk
menunjukkan keberadaan antibodi  pemfigus pada serum pasien.
 Dua tahun kemudian (1967), tim yang sama mendemonstrasikan
hasil pemeriksaan pada pemfigoid bulosa.
 Di bidang dermatologi, pemeriksaan imunofluoresensi merupakan
pemeriksaan penunjang dengan manfaat untuk membantu diagnosis 
beberapa dermatosis vesikobulosakronik, melihat keaktifan penyakit
vesikobulosa kronik (contoh: pemfigus), membantu diagnosis
penyakit jaringan konektif (contoh: lupus eritematosus sistemik),
dan membantudiagnosis penyakit vaskulitis.
Regensia serta Alat dan Bahan yang digunakan dalam Metode
FAT (IFA)

 Deckglass  Gelas Inkubator

 Objek glas  Kotak inkubator
 Serum sampel  Inkubator 37oC
 Antigen dari sel kultur  Konjugat Fragmen
atau antigen dari jaringan immunoglobulin
 Aceton  Mikroskop Fluorescent
 Feotal Calf Serum (FCS)  Rhodamin.
 Phospat Buffer Saline
(PBS)
 Pinset
PRINSIP DASAR PEMERIKSAAN
IMUNOFLUORESENSI

 Pemeriksaan imunofluoresensi digunakan untuk

deteksi autoantibodi. Deteksi dilakukan dengan
memberikan suatu anti-autoantibodi (antibodi
sekunder) terkonjugasi fluorokrom yang kemudian
akan berikatan dengan autoantibodi tubuh (antibodi
primer),dan diamati melalui mikroskop fluoresen.
Antibodi sekunder yang diberikan dapat berupa
antibodi anti terhadap imunoglobulin, komplemen,
atau fibrinogen.
MACAM-MACAM PEMERIKSAAN
IMMUNOFLUORESENSI

A. Pemeriksaan imunofluoresensi direk (IFD)

bertujuan untuk mendeteksi antibodiyang melekat
pada jaringan secara in vivo,
B. Pemeriksaan imunofluoresensi indirek (IFI)
bertujuan untuk mendeteksi antibodi dalam serum
(circulating antibody).
A.PEMERIKSAAN IMUNOFLUORESENSI
Pemeriksaan imunofluoresensi direct
 Sampel untuk pemeriksaan imunofluoresensi direk (IFD) berupa
potongan
jaringan perilesi dan kulit normal tepi gelembung yang masih baru.
Sampel yang diambil pada gelembung dapat memberikan hasil
negatif palsu karena telah terjadi degradasi imunoglobulin.
 Gelembung dipilih yang baru muncul (kurang dari 24 jam) untuk
mencegah perubahan seperti regenerasi, degenerasi, bahkan disertai
infeksi sekunder yangmenyulitkan pembacaan. Lesi dieksisi dengan
skalpel secara elips, eksisi dengan teknik punch harus dihindari
karena tekanan teknik ini menyebabkan gelembung terdisintegrasi.
Namun,teknik punch masih dapat digunakan untuk sampel berupa
kulit/ mukosa normal.
 Untuk membersihkan darah dan protein jaringan. Kemudian segera
dibekukan ( snap freezing/ rapid freezing ) dalam suhu -70C hingga
sampel digunakan.
  Jaringan dapat menggunakan nitrogen cair, karbondioksida
beku, atau dengan cairan fiksasi Michel’s dalam suhu ruangan.
Cairan fiksasi ini mencegah degenerasi jaringan
danimunoreaktan dengan menghambat kerja enzim proteolitik
jaringan.
 Tahap selanjutnya adalah jaringan dipotong dan diletakkan di
atas gelas objek kemudian dilakukan Labelling .
 Labelling adalah suatu proses dimana jaringan yang akan
diperiksa diinkubasikan dengan anti-autoantibodi terkonjugasi
fluorokrom (antibodisekunder). 
 Antibodi sekunder yang digunakan adalah antibodi anti
terhadap IgG, IgM,IgA, komplemen komponen 3 (C3),
atau fibrinogen. 
  Tahapan labeling dilakukan dalam moist chamber
pada suhu 37°C selama 30 menit. Sampel yang terlabel ini
kemudianditetesi buffered  glycerol dan dilihat dengan
mikroskop fluoresensi.
 Melalui mikroskop fluoresen diamati distribusi dan jenis

depositin vivo dariantibodi, tipe dan subtipe dari imunoglobulin,

dan ada/tidaknya komplemen. Letak deposityang diamati
umumnya pada epidermis, membran basalis, dan dermis. Pola
deposit yangdiamati berupa deposit interselular pada epidermis
atau deposit pada basement membrane zone (BMZ). Pola
deposit pada BMZ dapat berupa linear, granular, atau kombinasi
keduanya.
A.PEMERIKSAAN IMUNOFLUORESENSI
Pemeriksaan imunofluoresensi Indirect

 Sampel pada pemeriksaan imunofluoresensi indirek (IFI) adalah serum

darah pasien. Sampel didapat dengan mengambil darah vena sebanyak
10 ml tanpa anti-koagulan dan diinkubasikan dalam suhu 37°C selama
1 jam untuk mendapatkan serum darah.
 Serum darah yang didapat disentrifugasi, kemudian diaspirasi dengan
pipet ke dalam tabung steril,dan disimpan pada suhu -25°C hingga
sampel digunakan. Serum harus dibekukan untukmencegah hemolisis
yang kemudian dapat menghancurkan autoantibodi.
 Serum pasien yang akan digunakan kemudian diencerkan 1:10 dan
1:80.
 Sebelum dilakukan tahapan labelling , substrat yang akan digunakan
hendaknya disiapkan terlebih dahulu. Substrat yang umumnya berupa
esofagus kera, esophagus guinea pig, kulit manusia, atau kulit katak.
Video Pemeriksaan Immunofluoresensi
KESIMPULAN
 Imunofluoresen adalah metode imunologi untuk
mendeteksi antibodi dari berbagai kelas immunoglobulin
dalam serum, cairan ludah, cairan otak dengan cara
mereaksikan antibody dan antigen spesifik dan anti-
antibodi yang dilabel denagan Fluoresence Isothiocyanat
(FITC), sehingga terpancar sinar warna hijau atau merah
jika di label denganRodhamin. Tetapi dalam
perkembangan sekarang imunofluoresen banyak
digunakan dalam penelitian untuk mendeteksi antigen
antigen atau antibody dalam mukosa usus, mukosa
mulut, dan dalam jaringan, urine, cairan mata.