IMMUNOFLUORESCENCE

Teknik pewarnaan secara immunofluorescence berprinsipkan atas ikatan antigen antibody yang
dilabel dengan fluorochrome (pewarna fluorescence). Protokol immunofluorescence sama dengan
protocol IHC hanya saya pelabelnya yang berbeda. Teknik immunofluorescence juga dapat dibedakan
menjadi direct immunofluorescence dan indirect immunofluorescence. Direct immunofluorescence
menggunakan antibody yang terkonjugasi dengan fluorochrome (fluorochrome-conjugated antibody)
sedangkan indirect immunofluorescence menggunakan antibody sekunder (antibody yang bersifat
anti dari antibody primer). Antibody sekunder yang digunakan adalah antibody yang terkonjugasi
dengan fluorochrome (fluorochrome-conjugated secondary antibody) ataupun antibody yang
terbiotinilasi (biotin-conjugated secondary antibody). Pada penggunaan biotin-conjugated secondary
antibody, fluorochrome akan berikatan avidin maupun streptavidin dimana avidin atau streptavidin
ini akan berikatan dengan biotin pada antibody sekunder. Keuntungan teknik indirect
immunofluorescence adalah kita dapat meningkatkan jumlah fluorophore (Zola, 1998).

Gambar 2. Teknik immunofluorescence. A: direct immunofluorescence, B: indirect

immunofluorescence (fluorochrome-conjugated secondary antibody), C: indirect
immunofluorescence (biotin-conjugated secondary antibody + avidin / streptavidin-flourescein)(Zola,
1998).

Berikut adalah fluorophore beserta data absorpsi dan emisi pada fluorescence.

Tabel 1. Fluorophore beserta data absorpsi dan emisi pada fluorescence

Prosedur immunofluorescence memiliki kelebihan pada prosedur multi-labelling. Dalam satu jaringan
dengan satu prosedur pewarnaan kita dapat melabel 2 atau lebih antigen. Double labelling dapat
dilakukan dengan syarat spesies antibody primer yang digunakan adalah berbeda, misalnya antibody
A dalam mouse dan antibody B dalam rabbit.

Gambar 3. Doubel immunofluorescence (Vector Laboratories, Inc. 2005)

Gambar 4. Prosedur double immunofluorescence. Pada teknik double labelling di atas menggunakan
dua avidin conjugate yaitu: fluorescein avidin DC (hijau) dan texas red avidin DCS (merah) (Vector
Laboratories, Inc. 2005)

Gambar 5. Pewarnaan double immunofluorescence. Pada teknik double labelling di atas

menggunakan rabbit polyclonal anti-P antibody virus rabies (P), Mab 62B5 anti-N antibody virus rabies
(N) dan polyclonal anti-M antibody virus rabies (M). DAPI (biru) digunakan untuk mewarnai nuclei
(merge). Colocalization bewarna kuning (merge). Pengamatan menggunakan confocal laser
microscopy (Lahaye et al., 2009).
Daftar Pustaka
Lahaye. X., 2009. Aurore Vidy, Carole Pomier, Linda Obiang, Francis Harper,Yves Gaudin, and Danielle
BlondelFunctional Characterization of Negri Bodies (NBs) in Rabies Virus-Infected Cells: Evidence that
NBs Are Sites of Viral Transcription and Replication, Journal of virology, p. 7948–7958

Zola. H., 1998. Detection of Cytokine Receptors by Flow Cytometry. Current Protocols in
Immunology . http://www.currentprotocols.com/protocol/im0621

Vector Laboratories, Inc. 2005.DISCOVERY through color A Guide to Multiple Antigen

Labelinghttp://www.vectorlabs.com