BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Pada mulanya imunologi merupakan cabang mikrobiologi yang mempelajari respons
tubuh, terutama respons kekebalan terhadap penyakit infeksi. Imunologi adalah suatu cabang
yang luas dari ilmu biomedis yang mencakup kajian mengenai semua aspek sistem imun
(kekebalan) pada semua organisme. Imunologi antara lain mempelajari peranan fisiologis
sistem imum baik dalam keadaan sehat maupun sakit; malfungsi sistem imun pada gangguan
imunologi karakteristik fisik, kimiawi, dan fisiologis komponen-komponen sistem imun.
Tubuh manusia tidak mungkin terhindar dari lingkungan yang mengandung mikroba
pathogen disekelilingnya. Mikroba tersebut dapat menimbulkan penyakit infeksi pada
manusia. Mikroba patogen yang ada bersifat poligenik dan kompleks. Oleh karena itu respon
imun tubuh manusia terhadap berbagai macam mikroba patogen juga berbeda. Umumnya
gambaran biologic spesifik mikroba menentukan mekanisme imun mana yang berperan
untuk proteksi. Begitu juga respon imun terhadap bakteri khususnya bakteri ekstraseluler
atau bakteri intraseluler mempunyai karakteriskik tertentu pula.
Tubuh manusia akan selalu terancam oleh paparan bakteri, virus, parasit, radiasi
matahari, dan polusi. Stress emosional atau fisiologis dari kejadian ini adalah tantangan lain
untuk mempertahankan tubuh yang sehat. Biasanya kita dilindungi oleh system pertahanan
tubuh, sistem kekebalan tubuh, terutama makrofag, dan cukup lengkap kebutuhan gizi untuk
menjaga kesehatan. Kelebihan tantangan negattif, bagaimanapun, dapat menekan system
pertahanan tubuh, system kekebalan tubuh, dan mengakibatkan berbagai penyakit fatal.
Imunohistokimia merupakan suatu cara pemeriksaan untuk mengukur derajat
imunitas atau kadar antibodi atau antigen dalam jaringan.Kata imunohistokimia diambil dari
kata immuneyang menunjukkan bahwa prinsip dasar dalam proses ini adalah penggunaan
antibodi dan histoyang menunjukkan jaringan secara mikroskopis
1.2 Rumusan Masalah
1. Apa pengertian imunohistokimia?
2. Apa saja teknik imunohistokimia?
3. Apa saja masalah yang dapat terjadi dalam teknik imunohistokimia?
1.3 Tujuan
1. Kita dapat mengetahui dan memahami pengertian imunohistokimia.
2. Kita dapat mengetahui dan memahami teknik imunohistokimia.
3. Kita dapat mengetahui dan memahami masalah yang dapat terjadi dalam teknik
imunohistokimia.
 BAB II
PEMBAHASAN
2.1 Imunohistokimia
Imunohistokimia adalah suatu metode kombinasi dari anatomi, imunologi dan
biokimia untuk mengidentifikasi komponen jaringan yang memiliki ciri tertentu dengan
menggunakan interaksi antara antigen target dan antibodi spesifik yang diberi
label. Imunohistokimia merupakan suatu cara pemeriksaan untuk mengukur derajat imunitas
atau kadar antibodi atau antigen dalam sediaan jaringan. Nama imunohistokimia diambil dari
nama immune yang menunjukkan bahwa prinsip dasar dalam proses ini ialah penggunaan
antibodi dan histo menunjukkan jaringan secara mikroskopis. Dengan kata lain,
imunohistokimia adalah metode untuk mendeteksi keberadaan antigen spesifikdi dalam sel
suatu jaringan dengan menggunakan prinsip pengikatan antara antibodi (Ab) dan antigen
(Ag) pada jaringan hidup. Pemeriksaan ini membutuhkan jaringan dengan jumlah dan
ketebalan yang bervariasi tergantung dari tujuan pemeriksaan.
Teknik imunohistokimia bermanfaat untuk identifikasi, lokalisasi, dan karakterisasi
suatu antigen tertentu, serta menentukan diagnosis, therapi, dan prognosis kanker. Teknik ini
diawali dengan pembuatan irisan jaringan (histologi) untuk diamati dibawah mikroskop.
Interaksi antara antigen-antibodi adalah reaksi yang tidak kasap mata. Tempat pengikatan
antara antibodi dengan protein spesifik diidentifikasi dengan marker yang biasanya
dilekatkan pada antibodi dan bisa divisualisasi secara langsung atau dengan reaksi untuk
mengidentifikasi marker. Adapun beberapa marker yang berupa senyawa berwarna antara
lain :
a. Luminescence
b. Zat berfluoresensi : fluorescein, umbelliferon, tetrametil rodhamin
c. Logam berat : colloidal, microsphere, gold, silver, label radioaktif
d. Enzim : Horse Radish Peroxidase (HRP) dan alkaline phosphatase.

Enzim (yang dipakai untuk melabel) selanjutnya direaksikan dengan substrat

kromogen (yaitu substrat yang menghasilkan produk akhir berwarna dan tidak larut) yang
dapat diamati dengan mikroskop bright field (mikroskop bidang terang). Akan tetapi seiring
berkembangnya ilmu pengetahuan khususnya dunia biologi, teknik imunohistokimia dapat
langsung diamati (tanpa direaksikan lagi dengan kromogen yang menghasilkan warna)
dibawah mikroskop fluorescense.
Langkah-langkah dalam melakukan imunohistokimia dibagi menjadi 2, yaitu
preparasi sampel dan labeling. Preparasi sampel adalah persiapan untuk membentuk preparat
jaringan dari jaringan yang masih segar. Preparasi sample terdiri dari pengambilan jaringan
yang masih segar, fiksasi jaringan biasanya menggunakan formaldehid, embedding jaringan
dengan parafin atau dibekukan pada nitrogen cair, pemotongan jaringan dengan
menggunakan mikrotom, deparafinisasi dan antigen retrieval untuk membebaskan epitop
jaringan, dan bloking dari protein tidak spesifik lain. Sampel labeling adalah pemberian
bahan-bahan untuk dapat mewarnai preparat. Sampel labeling terdiri dari imunodeteksi
menggunakan antibodi primer dan sekunder, pemberian substrat, dan counterstaining untuk
mewarnai jaringan lain di sekitarnya.
Antibodi adalah suatu imunoglobulin yang dihasilkan oleh sistem imun dalam
merespon kehadiran suatu antigen tertentu. Antibodi dibentuk berdasarkan antigen yang
menginduksinya. Beberapa antibodi yang telah teridentifikasi adalah IgA, IgD, IgE, IgG, dan
IgM. Antigen adalah suatu zat atau substansi yang dapat merangsang sistem imun dan dapat
bereaksi secara spesifik dengan antibodi membentuk kompleks terkonjugasi. Ikatan antibodi-
antigen divisualisasikan menggunakan senyawa label/marker.
IHC merupakan teknik deteksi yang sangat baik dan memiliki keuntungan yang luar
biasa untuk dapat menunjukkan secara tepat di dalam jaringan mana protein tertentu yang
diperiksa. IHC juga merupakan cara yang efektif untuk memeriksa jaringan. Teknik ini telah
digunakan dalam ilmu saraf, yang memungkinkan peneliti untuk memeriksa ekspresi protein
dalam struktur otak tertentu. Kekurangan dari teknik ini adalah kurang spesifik terhadap
protein tertentu tidak seperti teknik imunoblotting yang dapat mendeteksi berat molekul
protein dan sangat spesifik terhadap protein tertentu. Teknik ini banyak digunakan dalam
diagnostik patologi bedah terhadap kanker, tumor, dan sebagainya. Adapun marker untuk
diagnosa IHC adalah sebagai berikut:
a. Carcinoembryonic antigen (CEA): digunakan untuk identifikasiadenocarcinoma.
b. Cytokeratins: digunakan untuk identifikasi carcinoma tetapi juga dapat terekspresi dalam
beberapa sarkoma.
c. CD15 and CD30 : digunakan untuk identifikasi Hodgkin's disease
 d. Alpha fetoprotein: untuk tumor yolk sac dan karsinoma hepatoselluler
e. CD117 (KIT): untuk gastrointestinal stromal tumors (GIST)
f. CD10 (CALLA): untuk renal cell carcinoma dan acute lymphoblastic leukemia
g. Prostate specific antigen (PSA): untuk prostate cancer estrogens danprogesterone
staining untuk identifikasi tumor
h. Identifikasi sel B limfa menggunakan CD20
i. Identifikasi sel T limfa menggunakan CD 3
Langkah-langkah dalam melakukan imunohistokimia dibagi menjadi dua, yaitu preparasi
sampel dan sampe labelling.
1. Preparasi sampel adalah persiapan untuk membentuk preparat jaringan dari jaringan yang
masih segar.
Preparasi sample terdiri dari :
a. pengambilan jaringan yang masih segar,
b. fiksasi jaringan biasanya menggunakan formaldehid,
c. embedding jaringan dengan parafin atau dibekukan pada nitrogen cair,
d. pemotongan jaringan dengan menggunakan mikrotom,
e. deparafinisasi dan antigen retrieval untuk membebaskan epitop jaringan,
f. bloking dari protein tidak spesifik lain.

2. Sampel labeling adalah pemberian bahan-bahan untuk dapat mewarnai preparat.

Sampel labeling terdiri dari :
a. imunodeteksi menggunakan antibodi primer dan sekunder,
b. pemberian substrat,
c. counterstaining untuk mewarnai jaringan lain di sekitarnya.
2.2 Teknik Imunohistokimia
a. Teknik imunofluoresensi
Tujuan penggunaan teknik ini adalah pengenalan antigen dengan antibody
spesifik dan visualisasinya dengan label, contohnya fluorescin, Rhodamin dan enzim
yang direaksikan dengan substrat kromogenik. Teknik ini disebut juga fluorescent
immunoassay (FIA). Ada dua cara yaitu cara langsung, yang digunakan untuk
menemukan antigen, immunoglobulin, atau komplemen yang melekat pada sel jaringan
penderita. Sedangkan cara tidak langsung lebih banyak digunakan untuk menemukan
antibody. Pada cara ini serum penderita direaksikan dengan sel atau jaringan kemudian
ditambahkan anti antibody yang bertanda fluorescent dan diperiksa dibawah mikroskopi
ultraviolet atau mikroskop fluoresensi.
Fluoresesnsi dan fosforesensi adalah emisi cahaya yang absorbsinya dari sumber
energy nontermal, seperti sinar ultraviolet atau sinar tampak. Fluoresensi hanya ada
sepanjang stimulasi sinar juga ada, sedangakan fosforesen tetap ada meskipun sumber
energy atau stimulasi cahaya hilang. Penggunaan yang umum sumber cahaya dalam
mikroskop fluoresensi adalah lampu merkuri tekanan tinggi yang mensuplai radiasi
ultraviolet dengan intensif. Sumber cahaya lain adalah halogen tungsten. Mikroskop
fluoresensi juga menggunakan transmisi cahaya lain yang direfleksikan ke specimen.
Dalam transmisi cahaya mikroskop fluoresensi, sinar pertama melalui filter pembangkit
yang secara selektif memblok panjang gelombang tertentu.
Pelebelan dengan menggunakan fluorokrom dapat digunakan untuk mendeteksi
antigen dalam berbagai preparat sel dan jaringan. Sel sel yang diperoleh melalui
perusakan mekanis specimen jaringan atau sel eksfoliatif, eksudat, aspirasi biopsy, darah
dan kultur sel jaringan, dapat diwarnai dengan imunofluoresensi.sel sel tersebut
dipersiapkan sebagai fresh frozen atau potongan jaringan segar beku yang terifiksasi.
Immunofluoresensi langsung , secara mikroskopik relative kurang sensitive,
sehingga sebagian besar terbuat dalam bentuk jaringan segar beku atau preparat sel yang
dibuat difiksir dengan bahan fiksatif crosslink seperti formalin. Kadang kadang
digunakan fiksasi aseton, etanol, atau methanol untuk memperjelas jaringan morfologi
atau menginaktifkan pathogen. Metode jaringan segar beku untuk immunofluoresensi
hamper sama dengan yang digambarkan pada teknik imunoenzim.
Teknik pewarnaan imunofluoresensi langsung paling banyak digunakan karena lebih
cepat dan sederhana. Pewarnaan yang tampak merupakan hasil reaksi dari fluorokrom-
antibody berlabel dengan antigendalam suatu substrat. Keadaan ini dicapai dalam
pemaparan substrat ke fluorokrom label antibody. Pengenalan antibody antigen spesifik
akan membuat ikatan tersebut ke preparat pada tempat antigen berada. Antibody yang
tidak terikat dicuci dengan buffer netraldan tempat ikatan antibody diidentifikasi dengan
mikroskop fluoresensi.
 Teknik imunofluoresensi mempunyai kelebihan yaitu relative mudah penggunaan
reagennya dengan prosedur kerja yang simple. Hany a tahap pencucian dibutuhkan
setelah pelebelan antibody dan tidak membutuhkan reagen dalam prosedurimunoenzim.
Kekurangan teknik ini adalah membutuhkan mikroskop khusus yang mahal, preparat
tidak bersifat permanen dan visualisasi gambaran sitomorfologi kurang jelas.
b. Teknik imunoenzim
Definisi teknik imunoenzim adalah suatu teknik imunologi berdasarkan pada
penggunaan ikatan dengan enzim spesifik, ikatan antienzim antibody yang diikuti dengan
enzim homolognya, kompleks enzim antienzim. Keseluruhan teknik ini digunakan secara
histology untuk visualisasi dan untuk mengetahui letak antigen.
Aktifitas enzimatik menginduksi perubahan warna yang tampak dalam substrat
dan kromogen dalam lokasi kompleks antibody enzim diantara jaringan yaitu tempat
reaksi antigen antibody spesifik. Enzim HRP adalah prototype dari metode imunoenzim,
namun system enzim lain seperti glukosa oksidase. Banyak sumber komersil yang
menawarkan enzim antibody konjugasi yaitu kromogen sebagai bahan yang mengandung
reagen yang cocok untuk segala tipe prosedur pewarnaan imunoenzim.
1. Direct imunoenzim staining
Pada teknik ini digunakan enzim antibody konjugasi untuk mengikat enzim pada
antigen dalam suatu potongan jaringan. Bagian ini kemudian dinkubasi dengan
substrat hydrogen peroksida dan kromogen diaminobenzinide (DAB), untuk
menghasilkan hasil reaksi dengan warna coklat yang dapat dilihat dengan mikroskop
cahaya.
2. Indirect imunoenzim staining.
Pada teknik ini mebutuhkan inkubasi awal potongan jaringan dengan suatu bentuk
potongan jaringan dengan suatu antibody promer spesifik untuk mencari antigen.
Potongan dicuci dan diinkubasi dengan suatu ikatan enzim antobodi sekunder yang
spesifik immunoglobulin dari spesies sumber antibody primer. Kelebihan dari tahap
ini adalah kemampuan menggunakan satu preparat konjugasi enzim antibody untuk
mengikat berbagai antibody primer dari spesies yang digunakan.
 3. Teknik enzim antienzim
Metode Peroxidase-anti-Peroxidase (PAP) adalah analisis imunohistokima yang
menggunakan tiga molekul peroksidase dan dua antibody yang membentuk seperti roti
sandwich. Teknik ini memanfaatkan afinitas antibody terhadap antigen (enzim) untuk
membentuk kompleks imun stabil sebagai perlawanan terhadap proses kimia
terkonjugasi. Hal unik dari prosedur ini adalah terbentuknya larutan enzim-antibodi
dan kompleks imun PAP. Enzim Horseradish Peroxidase dan protein imunogenik
digunakan untuk menyuntik spesies tertentu dan merespon imun poliklonal yang
dihasilkan terhadap enzim. Antiserum ini dipanen dan ditempatkan ke dalam larutan
enzim sehingga membentuk kompleks imun yang larut.
4. Teknik avidin-biotin
Metode Avidin-Biotin-Complex (ABC) adalah metode analisis
imunohistokimia menggunakan afinitas terhadap molekul avidin-biotin oleh tiga
enzim peroksidase. Pengikatan beberapa biotin dalam molekul avidin tetravalent
bertujuan untuk amplifikasi dan respon siyal yang disampaikan oleh antigen target.
Kelebihan teknik imunohistokimia adalah antibodi berikatan dengan antigen
yang spesifik, dapat digunakan untuk menentukan lokasi sel tertentu dan protein, dapat
digunakan untuk mengidentifikasi respon sel (contoh : apoptosis). Dalam ilmu saraf,
IHC memungkinkan peneliti untuk memeriksa ekspresi protein dalam struktur otak
tertentu. Sementara itu, kekurangan dari imunohistologi adalah kurang spesifik
terhadap protein tertentu tidak seperti teknik imunoblotting yang dapat mendeteksi
berat molekul protein dan sangat spesifik terhadap protein tertentu.

2.3 Masalah Teknik Imunohistokimia

1. Faktor-faktor pra analisis

Pemeriksaan ini merupakan pemeriksaan yang relative mudah dan murah.

Keuntungan lain dari teknik ini adalah dapat diterapkan pada sediaan rutin yang diterima
pada laboratorium histopatologi dan dapat dilakukan secara retrospektif pada sediaan-
sediaan arsip.
 Namun demikian, untuk mendapatkan hasil yang dapat dipercaya hasilnya,
sejumlah persyaratan harus dipenuhi. Fiksasi sangat penting peranannya, karena teknik
ini bertumpu pada reaktifitas antigen dalam sel. Fiksasi yang suboptimal dapat
menurunkan bahkan meniadakan reaktifitas antigen, sehingga memberikan sinyal yang
lemah atau negative palsu. Secara umum, proses fiksasi jaringan harus dilakukan
sesegera mungkin tanpa penundaan dan dilakukan dengan sempurna. Fiksasi yang
dianjurkan adalah da;am formalin berdapar fosfat 10%. Waktu fiksasi bervariasi antara 6
hingga 24 jam dan dalam keadaan terendam scara merata. Jika jaringan tumor berukuran
besar, maka harus dilakukan sayatan-sayatan parallel menyerupai “toast rack” berjarak 1
cm untuk menjamin paparan cairan formalin yang merata, dan jumlah cairan fiksatif
minimal 5-10 kali volume jaringan.

Selanjutnya, pengolahan jaringan harus dilakukan secara sempurna tahap demi

tahap melalui alcohol yang bertingkat kadarnya dan impregnasi dalam paraffin dengan
titik leleh maksimum 600C. Pengolahan jaringan yang tidak sempurna dapat menghambat
proses pulasan karena jaringan yang tidak homogen dalam paraffin mudah terlepas dari
kaca benda. Mudahnya jaringan terlepas dari kaca benda disebabkan karena pada proses
pulasan, dilakukan prosedur “antigen retrieval” yaitu pemaparan terhadap gelombang
elektromagnetik atau pemanasan; serta pemaparan dengan larutan-larutan yang keras
sifatnya, dimana tahapan-tahapan ini tidak dilakukan pada prosedur pulasan hematoksilin
eosin yang rutin.

2. Quality control” dan “Quality assurance”

Berbagai faktor menyebabkan perbedaan hasil pemeriksaan, antara lain jenis

antibody, metode “antigen retrieval”, factor-faktor preanalitik dan interpretasi hasil.
Untuk menekan perbedaan ini dianjurkan melakukan “quality control” dan “quality
assurance”.

3. Nilai cut off

Walupun sedikit, variasi dalam penggunaan nilai cut off masih dilaporkan.
Namun demikian, pada berbagai penelitian, untuk berbagai petanda lazimnya digunakan
nilai cut off 10%.
4. Tempat pemeriksaan

Teknik ini relative mudah dalam arti prosedurnya sederhana, namun diperlukan
kecermatan yang tinggi dalam pelaksanaannya pada setiap tahap. Di United State
Kingdom, dianggap bahwa laboratorium yang ideal adalah yang melakukan tes minimal
250 kasus dalam 1 tahun. Laboratorium lokal yang ingin melakukan tes ini sangat
dianjurkan untuk melakukan “quality assurance”.
 BAB III
PENUTUP
3.1 Kesimpulan
Sistem Imun adalah sistem perlindungan pengaruh luar Biologis yang dilakukan oleh
sil dan organ khusus pada suatu organisme. Jika sistem kekebalan bekerja dengan benar,
sistem ini akan melindungi tubuh terhadap infeksi bakteri dan virus, serta menghancurkan sel
kanker dan zat asing dalam tubuh. Jika sistem kekebalan melemah, kemampuannya
melindungi tubuh juga berkurang, sehingga menyebabkan patogen, termasuk virus yang
menyebabkan demam dan flu, dapa berkembang dalam tubuh.
3.2 Saran
Penulis menyadari bahwa Makalah ini masih jauh dari kesempurnaan yang diharapkan,
karena masih terbatasnya pengetahuan penulis. Olehnya itu penulis mengharapkan kritik dan
saran yang sifatnya membangun. Makalah ini perlu dikaji ulang agar dapat sempurna dan
makalah ini harus digunakan sebagaimana mestinya
MATA KULIAH HISTOKIMIA DAN IMUNOHISTOKIMIA
MAKALAH TEKNIK IMUNOHISTOKIMIA

OLEH:
ASNI RAMAYANA TINA
A201401014

D-IV ANALIS KESEHATAN

STIKES MANDALA WALUYA
KENDARI
2017
 DAFTAR PUSTAKA

http://gectriisna.blogspot.com/2011/11/makalah-imunologi.html
http://zahra-sanjaya.blogspot.com/2012/06/makalah-dasar-dasar-imunologi.html
http://sistempertahanantubuh.blogspot.com/2011/04/ketidakseimbangan-sistem-pertahanan.html
http://sistempertahanantubuh.blogspot.com/2011/04/respon-kekebalan.html
http://sistempertahanantubuh.blogspot.com/2011/04/mengenal-anti-bodi-dan-antigen.html
http://sistempertahanantubuh.blogspot.com/search/label/Organ%20penyusun%20sistem%20perta
hanan%20tubuh
http://sistempertahanantubuh.blogspot.com/2012/02/mekanisme-pertahanan-tubuh-
kekebalan.html
 KATA PENGANTAR

Bismillahirrahmanirrahim
Assalamu’alaikum Wr. Wb
Puji dan syukur kami panjatkan kepada Allah SWT atas berkat berkat dan rahmatnya
sehingga makalah ini dapat terselesaikan dengan baik. Makalah ini terdiri dari pokok
pembahasan mengenai teknik Imunohistokimia. Setiap pembahasan di bahas secara
sederhana sehingga mudah dimengerti.
Kami sadar, sebagai mahasiswi yang masih dalam proses pembelajaran, penulisan
dalam makalah ini masih banyak kekurangannya. Oleh karena itu, kami sangat
mengharapkan adanya kritik dan saran yang bersifat positif, guna penulisan makalah yang
lebih baik lagi di masa yang akan datang.
Wassalamu’alaikum Wr. Wb

Kendari, 24 november 2017

Penulis
PROPOSAL RANCANGAN USAHA MAHASISWA

OLEH:
ASNI RAMAYANA TINA
A201401014

D-IV ANALIS KESEHATAN

STIKES MANDALA WALUYA
KENDARI
2017