imunohistokimia adalah metode untuk mendeteksi protein di dalam sel suatu jaringan dengan menggunakan prinsip pengikatan antara

antibodi dan antigen pada jaringan hidup. Pengecatan imunohistokimia banyak digunakan pada pemeriksaan sel abnormal seperti sel kanker. Molekul spesifik akan mewarnai sel-sel tertentu seperti sel yang membelah atau sel yang mati sehingga dapat dibedakan dari sel normal.

Pemeriksaan ini membutuhkan jaringan dengan jumlah dan ketebalan yang bervariasi tergantung dari tujuan pemeriksaan. Umumnya jaringan yang berasal dari tubuh akan dipotong menjadi potongan yang sangat tipis dengan menggunakan alat yang disebut vibrating microtome.

Beberapa contoh imunohistokimia yang banyak digunakan antara lain :

Carcinoembryonic Antigen (CEA) mengidentifikasi adenocarcinoma. Sifat kurang spesifik.

Cytokeratins mengidentifikasi carcinoma, namun dapat pula member hasil positif pada kasus sarcoma.

CD 15 dan CD 30 digunakan untuk penyakit Hodgkin Alpha Fetoprotein untuk tumor yolk sac dan kanker sel hati CD 117 (KIT) untuk tumor gastrointestinal stromal Prostate Spesific Antigen (PSA) untuk kanker prostat Estrogen dan progesteron mendeteksi sel tumor CD 20 mengidentifikasi limfoma sel B CD 3 mengidentifikasi limfoma sel T

Modulasi ekspresi c-Myc sel epitelial kelenjar payudara tikus oleh ekstrak etanolik kulit jeruk keprok (Citrus reticulata) Maria Dwi Supriyati, Rosa Adelina, Dwi Ana Nawangsari, Muthi Ikawati dan Edy Meiyanto*) Cancer Chemoprevention Research Center (CCRC), Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta *Korespondensi : Dr. Edy Meiyanto, MSi., Apt Cancer Chemoprevention Research Center (CCRC), Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada e-mail: meiyan_e@yahoo.com URL : http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id Abstrak

Terapi penanganan defisiensi estrogen dengan Hormon Replacement Therapy (HRT) memiliki resiko besar terhadap terjadinya kanker. Alternatif penanganan lain yang relatif lebih aman yakni terapi dengan fitoestrogen. Senyawa fitoestrogen jika berinteraksi dengan reseptor estrogen (ER) mampu meningkatkan ekspresi c-Myc melalui pemicuan proliferasi sel. Kulit jeruk keprok mengandung senyawa golongan flavanon dan polimetoksiflavon yang diduga memiliki efek estrogenik sehingga berpotensi untuk dikembangkan sebagai fitoestrogen. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek estrogenik ekstrak etanolik kulit jeruk keprok (EJK) pada tikus yang diovariektomi melalui modulasi ekspresi c-Myc. Uji efek estrogenik dilakukan melalui studi in vivo. Tikus Sprague Dawley umur 50 hari yang diovariektomi dibagi menjadi 5 kelompok yakni kelompok baseline, kontrol pelarut, 17 estradiol (2g/hari), EJK 500 mg/kgBB dan EJK 1000 mg/kgBB. Selanjutnya tikus kelompok baseline dikorbankan pada umur 70 hari sedangkan keempat kelompok lain pada umur 70 hari mulai diberikan perlakuan masing-masing selama 14 hari. Pengamatan potensi efek estrogenik dilakukan terhadap perkembangan lobulus kelenjar payudara dan ekspresi cMyc. Hasil pengamatan Haematoksilin Eosin (HE) menunjukkan bahwa pemberian EJK dosis 500 mg/kgBB maupun dosis 1000 mg/kgBB mampu meningkatkan perkembangan lobulus kelenjar payudara. Hasil pengamatan secara imunohistokimia menunjukkan adanya peningkatan ekspresi c-Myc pada pemberian EJK dosis 500 mg/kgBB maupun dosis 1000 mg/kgBB. Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa EJK mampu meningkatkan perkembangan kelenjar payudara sehingga berpotensi untuk dikembangkan sebagai produk perawatan kesehatan wanita.

Kata kunci : Jeruk keprok (Citrus reticulata), kelenjar payudara, fitoestrogen, c-Myc. Pendahuluan Kecantikan dan kesuburan adalah dua hal utama yang dianggap penting dalam kehidupan wanita yang diwakili oleh wajah, payudara dan uterus. Ketiga bagian ini sangat dipengaruhi oleh keberadaan hormon estrogen yang sangat berperan dalam keberlangsungan fungsi fisiologis wanita, yaitu mulai dari mengatur siklus menstruasi dan reproduksi hingga berperan dalam modulasi kepadatan tulang dan transport kolesterol (Jordan, 2004). Kehilangan estrogen dalam jumlah besar berpengaruh besar terhadap penurunan kualitas hidup wanita karena dapat mempengaruhi keindahan maupun kesehatan payudara, dapat memicu terjadinya gangguan kesehatan alat reproduksi dan dapat menimbulkan gejala lainnya yang kurang menyenangkan pada wanita menopause (Achadiat, 2003). Untuk itu diperlukan asupan estrogen dari luar tubuh untuk tetap menjaga keberadaan dan fungsi estrogen dalam tubuh. Penanganan yang biasa diberikan oleh kalangan medis adalah dengan memberikan terapi hormon pengganti (Hormon Replacement Therapy/HRT) yang secara efektif berperan dalam mengurangi ketidaknyamanan saat gejala menopause menimpa seorang wanita. Terapi penanganan defisiensi estrogen dengan HRT memiliki resiko besar terhadap terjadinya kanker. Alternatif penanganan lain yang relatif lebih aman yakni terapi dengan fitoestrogen (Messina and Loprinzi, 2001). Fitoestrogen termasuk isoflavon, lignin dan senyawa steroidal lain ditemukan dalam tanaman maupun produk tanaman. Salah satu contoh fitoestrogen adalah senyawa flavonoid yang banyak terdapat dalam tumbuh-tumbuhan (Achadiat, 2003). Jeruk keprok (Citrus reticulata) yang kaya akan senyawa flavonoid ternyata mengandung senyawa golongan flavanon dan polimetoksiflavon yang jarang terdapat pada tanaman lain misalnya tangeretin, hesperidin, hesperetin, rutin, nobiletin, naringin dan naringenin (Choi et al., 2007). Senyawa-senyawa

tersebut dapat berikatan dengan dengan reseptor estrogen dan diduga menghasilkan efek estrogenik melalui mekanisme yang serupa dengan estradiol (Santell et al., 1997). Metodologi Bahan Utama : Ekstrak etanolik kulit jeruk keprok Jeruk keprok diperoleh dari daerah Tawangmangu dan telah dideterminasi di Bagian Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi UGM sebagai Citrus reticulata; kulit jeruk dibersihkan dengan dicuci dengan air mengalir, dikeringkan dengan diangin-anginkan dalam ruang terbuka tanpa terkena sinar matahari secara langsung, kemudian ditumbuk hingga diperoleh serbuk halus dan kering. Ekstrak etanolik jeruk keprok (EJK) diperoleh dengan cara mengekstraksi serbuk kering kulit jeruk keprok dengan pelarut etanol 70% dalam erlenmeyer. Untuk setiap satu gram bagian serbuk digunakan 10 liter bagian etanol 70%. Selanjutnya, disaring dan diambil sarinya. Filtrat diuapkan dengan rotary evaporator hingga menghasilkan ekstrak kental dengan berat konstan. Hewan Uji Hewan uji yang digunakan adalah tikus betina (Rattus norvegicus) galur Sprague Dawley (SD) umur 50 hari yang berasal dari Unit Pemeliharaan Hewan Penelitian UGM yang dirawat sesuai standar laboratorium. Perlakuan : Efek Estrogenik terhadap perkembangan kelenjar payudara tikus. Dua puluh empat ekor tikus diovariektomi pada umur 50 hari. Empat ekor tikus dikorbankan pada umur 70 hari sebagai baseline untuk pengamatan perkembangan kelanjar payudara. Empat ekor tikus pada umur 70 hari mulai diberikan perlakuan dengan suspensi CMC-Na 0,5% selama 14 hari sebagai kelompok kontrol pelarut. Enam ekor tikus pada umur 70 hari mulai diberikan perlakuan dengan 17- estradiol (2 g/hari) selama 14 hari. Enam ekor tikus pada umur 70 hari mulai diberikan perlakuan dengan EJK 500 mg/kgBB selama 14 hari. Enam ekor tikus pada umur 70 hari mulai diberikan perlakuan dengan EJK 1000 mg/kgBB selama 14 hari. Pada akhir percobaan, semua tikus dikorbankan dengan cara dislokasi leher untuk diamati perkembangan kelenjar mammae dengan pengecatan Haematoksilin Eosin (HE) pada irisan mammae kemudian diamati dibawah mikroskop cahaya (Zeiss). Pengamatan ekspresi c-Myc pada sel-sel epitel duktus dan lobulus dengan teknik immunohistokimia menggunakan antibodi c-Myc dilakukan pada irisan mammae yang lain. Hasil dan Pembahasan Percobaan secara in vivo penting dilakukan untuk mengetahui efek EJK secara sistemik, karena aplikasi dimasyarakat pada dasarnya juga bersifat sistemik meskipun dilakukan secara topikal. Aplikasi EJK secara topikal tidak mungkin dilakukan pada percobaan menggunakan tikus karena anatomi kulit tikus berbeda dengan kulit manusia. Oleh karena itu pada percobaan ini aplikasi perlakuan EJK dilakukan secara peroral dengan dosis yang relatif rendah yaitu 500 mg/kgBB dan 1000 mg/kgBB yang merupakan hasil konversi dosis genistein pada percobaan yang sama (Santell et al, 1997) dengan asumsi kadar flavonoid/isoflavon pada ekstrak sebesar 10-20% (data tidak ditunjukkan). Hasil dari percobbaan in vivo menunjukkan bahwa pemberian EJK memiliki kecenderungan peningkatan pertumbuhan kelenjar mammae. Sementara pada tikus diawal percobaan (baseline) belum menampakkan adanya pertumbuhan kelenjar mammae. Hasil ini menunjukkan bahwa EJK mampu menstimulasi perkembangan kelenjar mammae. Pemberian EJK secara per oral juga mampu meningkatkan ekspresi reseptor protein c-Myc. Secara in vivo EJK menunjukkan efek estrogenik. Hal ini dapat dilihat dari pengamatan secara kualitatif sel lobulus secara mikroskopis dengan pengecatan HE dan pengecatan

imunohistokimia untuk melihat ekspresi c-Myc (Gambar 1 dan 2). Pada pengecatan HE terjadi peningkatan jumlah sel lobulus yang ditunjukkan warna ungu pada sitoplasma sel lobulus payudara tikus yang diberi perlakuan EJK 500 mg/kgBB maupun EJK 1000 mg/kgBB dibandingkan dengan kontrol CMC-Na. Sedangkan peningkatan ekspresi c-Myc ditunjukkan dengan peningkatan intensitas warna coklat pada sel lobulus pada tikus dengan perlakuan EJK 500 mg/kgBB maupun EJK 1000 mg/kgBB dibandingkan kontrol CMC-Na.

Gambar 1. Pengecatan HE terhadap irisan kelenjar mammae, preparat diamati dibawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 40x (A) Kelompok CMC Na 0,5% (B) Kelompok Estradiol (C) Kelompok EJK 500mg/kgBB (D) Kelompok EJK 1000 mg/kgBB. Secara in vivo EJK menunjukkan efek estrogenik yang cukup signifikan. Kemungkinan besar kandungan flavonoid pada EJK tersebut mampu berinteraksi dengan reseptor estrogen sehingga dapat meningkatkan proliferasi sel-sel epitel duktus dan lobulus yang merupakan ciri khas sel-sel tersebut. Efek estrogenik ekstrak etanolik kulit jeruk keprok (EJK) menyerupai efek genistein terhadap sel epitelial payudara maupun pada uterus. Berdasarkan penelitian Murkies et al. (1998) diketahui bahwa pada kadar rendah genistein menunjukkan efek estrogenik sedangkan pada kadar tinggi menunjukkan efek antiestrogenik sehingga mampu menekan pertumbuhan sel kanker payudara.

Gambar 2. Hasil pengamatan imunohistokimia protein c-Myc dengan perbesaran 100x.(A) Kontrol negatif CMC-Na 0,5% (B) Kontrol positif (estradiol 2 g/hari) (C) Perlakuan EJK 500mg/kgBB (D) Perlakuan EJK 1000mg/kgBB. Efek estrogenik ini disebabkan dengan adanya ikatan antara fitoestrogen dengan reseptor estrogen sehingga terjadi pengaktifan reseptor estrogen. Reseptor estrogen yang telah aktif akan berinteraksi dengan ERE (estrogen Response Element) yang terdapat dalam nukleus sehingga mampu menginduksi ekspresi estrogen responsive gene, salah satunya adalah protein c-Myc (Gambar 3). Protein c-Myc yang terekspresi akan memicu terjadinya daur sel dan meningkatkan proliferasi sel-sel epitelial payudara dan sel-sel uterus (Gruber et al., 2002).

Gambar 3. Jalur klasik signal transduksi estrogen. Aktivasi reseptor estrogen oleh estrogen endogen maupun fitoestrogen, menginduksi interaksi reseptor estrogen dengan estrogen response element, yang menginisiasi ekspresi estrogen responsive gene : protein petanda proliferasi sel c-Myc.

EJK mampu meningkatkan perkembangan kelenjar mmammae pada tikus terovariektomi, yang berarti tikus tersebut tidak menghasilkan estrogen. Hal ini memberikan informasi bahwa ekstrak tersebut dapat digunakan dan akan memberikan efek pada pemakaiannya secara normal dalam kondisi defisiensi estrogen. Adanya fenomena bahwa EJK mampu meningkatkan ekspresi reseptor estrogen memberikan dugaan kuat bahwa efek peningkatan perkembangan kelenjar mammae tersebut tidak hanya disebabkan oleh efek estrogeniknya tetapi juga kemungkinan oleh adanya mekanisme lain yang menyebabkan peningkatan ekspresi reseptor estrogen. Peningkatan ekspresi reseptor estrogen merupakan hal yang penting agar sel-sel epitel tersebut semakin responsif terhadap estrogen maupun fitoestrogen sehingga kemudian dapat berproliferasi. Dari hasil penelitian ini maka perlu dilakukan peneltian lebih lanjut untuk mengetahui dosis optimum penggunaan EJK sebagai fitoestrogen. Penggunaan dan aplikasi EJK sebagai fitoestrogen baik dilakukan oleh wanita yang mengalami defisiensi estrogen misalnya wanita yang mengalami menopause. Selain itu estrogen juga mempengaruhi transpor kolesterol dan kepadatan tulang, sehingga perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui aktivitas EJK yang bersifat estrogenik terhadap transpor kolesterol maupun kepadatan tulang. Meskipun demikian hal yang juga perlu diperhatikan adalah apakah peningkatan ekspresi reseptor estrogen ini juga tergantung dosis. Apabila peningkatan ekspresi reseptor estrogen tersebut berbanding lurus dengan peningkatan dosis maka perlu diwaspadai penggunaannya bagi waita yang memiliki resiko terkena kanker payudara. Kesimpulan Kulit jeruk keprok memiliki potensi yang besar untuk dikembangkan menjadi produk suplemen kesehatan. Ekstrak etanolik kulit jeruk keprok mampu meningkatkan ekspresi cMyc sehingga akan meningkatkan perkembangan kelenjar payudara. Peningkatan ini akan menghasilkan penambahan ukuran payudara namun dengan kondisi yang tetap kencang dan normal. Ucapan Terima Kasih Terimakasih kepada DP2M DIKTI yang telah membantu mendanai penelitian ini melalui PKM tahun 2008. Daftar Pustaka Achadiat, C.M., 2003, Fitoestrogen untuk Wanita Menopause, http://situs kesepro.info/aging/jul/2003/ag01.html, diakses September 2007. Choi, S.Y., Ko, H.C., Ko,S.Y., Hwang, J.H., Park,J.G., Kang, S.H., Han,S.H, Yun,S.H., and Kim,S.J., 2007, Correlation between Flavonoid Content and the NO Production Inhibitory Activity of Peel Extracts from Various Citrus Fruits, Biol. Pharm. Bul, 30: 772-778. Gruber , J.Chirstian., Tschugguel, M.D., Schneeberger, Christian, Huber, and C.Johannes, 2002, Production and Actions of Estrogens, The New England Journal of Medicine, 346(5). Jordan, V C., 2004, Selective Estrogen Receptor Modulation:Concept and Consequences in Cancer, l5:207-213. Messina, M.J. and Loprinzi, C.L, 2001, Soy for Breast Cancer Survivors: A Critical Review of the Literature, J.Nutr., 131 : 3095S-3108S. Murkies, A.L., Wilcox, G., and Davis, S.R., 1998, Phytoestrogens, J Clin Endocrinol Metab, 83:297-303. Santell, C.R., Chang, C.Y., Nair, G.M. and Helferich, G.W., 1997, Dietary Genistein Exerts Estrogen Effect upon the Uterus, Mammary Gland and the Hypothalamic/Pituitary Axis in Rats, Biochemical and Molecular Roles of Nutrients, 97:263-269.