Teknik Pembuatan

Preparat Histologi
 Teknik Pembuatan Preparat Histologi
•› Tahap perlakuan:
1.Pemilihan Jaringan
2.Fiksasi (Fixation)
3.Dehidrasi (Dehydration)
4.Pembeningan (Clearing)
5.Pembenaman (Impregnasi/Embedding)
6.Pengecoran (Blocking)
7.Pemotongan jaringan (Sectioning)
8.Deparafinisasi
9.Pewarnaan (Staining)
10. Perekatan (Mounting)
11.Pelabelan (Labelling)
1. Pengambilan Jaringan
• › Jaringan diambil sekecil mungkin, tetapi masih dapat
mewakili struktur keseluruhan (representatif).
• › Tebal jaringan tidak melebihi 1 cm; kalau bisa kurang
dari 5 mm.
• › Potong jaringan sekitar 1cm x 1cm untuk memudahkan
fiksasi, sehingga cairan fiksasi dapat menyerap sampai ke
seluruh jaringan.
2. Fiksasi
Fiksasi atau pengawetan  stabilisasi unsur
penting pada jaringan sehingga unsur tersebut
tidak terlarut, berpindah, atau mengalami
perubahan selama prosedur selanjutnya.
 Tujuan Fiksasi
• › Fiksasi terhadap jaringan harus dilakukan secepat mungkin, segera
setelah jaringan manusia diambil dari tubuhnya dengan tujuan:
1. Mengawetkan jaringan. Bertujuan untuk mempertahankan susunan
jaringan agar mendekati kondisi jaringan hidup.
2. Mencegah terjadinya proses autolisis yaitu larutnya sel yang diakibatkan
oleh proses – proses yang dipengaruhi enzim dari dalam sel itu sendiri.
3. Mencegah proses pembusukan yaitu proses penghancuran jaringan yang
diakibatkan oleh aktifitas bakteri dan biasanya disertai dengan
pembentukan gas.
4. Memadatkan dan mengeraskan jaringan agar mudah untuk dipotong.
Untuk jaringan yang lunak seperti jaringan otak akan sulit dipotong
jika tanpa dilakukan oleh cairan fiksasi.
5. Memadatkan cairan koloid, mengubah konsistensi dari bahan seperti
• cairan yang terdapat didalam jaringan menjadi konsistensi lebih padat.
• Fiksasi yang benar adalah dasar dari semua sajian
histologi yang baik. Kesalahan yang dilakukan pada
tahap ini tidak akan pernah dapat diperbaiki lagi pada
tahapan selanjutnya. Jadi, hasil akhir sajian histologi
yang baik sangat bergantung pada cara melakukan
fiksasi dengan baik.
•Syarat – syarat cairan
• › Cairan fiksasi yang digunakan mempunyai syarat – syarat
tertentu agar jaringan yang difiksasi tidak mengalami
kerusakan yaitu :
1.Mempunyai daya tembus yang kuat
2. Menembus jaringan secara merata
3. Dapat memfiksasi secara keseluruhan
4. Mempunyai daya tembus terus menerus
5.Tidak berakibat yang terlalu membahayakan terhadap
lingkungan
6.Dengan cairan fiksasi tersebut, jaringan harus dapat diwarnai
dengan berbagai macam tehnik dan jaringan tersebut dapat
disimpan untuk waktu yang lama.
•Ada dua macam fiksatif :
1. Larutan fiksatif sederhana.
• Hanya mengandung satu macam zat saja.
• Misal : etanol 70-100% ; Formaldehyde 4-10% ; Asam
asetat 0,3-5% ; Asam pikrat ; asam Chromiat 0,5-1 % dll.
2. Larutan fiksatif majemuk /
campuran.
Mengandung lebih dari satu
macam zat. Misal :
• larutan Bouin (asam pikrat, formalin dan asam asetat
glasial) Larutan Zenker (merkuri chlorida, potassium
dichromate, aquadest) dll.
• Larutan Zenker : Nuklei dan jaringan pengikat sangat
terpulas baik terutama jaringan tumor.
 Faktor yang mempengaruhi fiksasi

• › Hal yang harus diperhatikan dalam proses fiksasi

jaringan histologi:
a.Tebal irisan : jangan terlalu tebal (1cm x 1cm) supaya
mempermudah penyerapan cairan fiksatif merata ke
seluruh jaringan
b.Volume cairan fiksatif : harus sampai dapat merendam
seluruh bagian jaringan. Volume cairan fiksatif yang
dipakai paling sedikit 15 - 20 kali volume jaringan.
c. Jenis cairan fiksatif yang digunakan. Jenis fiksatif
yang dipergunakan, tergantung pada jenis jaringan
serta teknik pewarnaan apa yang nantinya akan
dipergunakan.
 Persiapan melakukan Fiksasi
• Alat :
1. Wadah tempat sampel jaringan
2. Cassette (3 x 4 x 1 cm)
3. Telenan
4. Scalpel atau Cutter
5. Pensil (untuk memberi tanda/kode jaringan)
6. Pinset (untuk mengambil jaringan)
7. Label
• Bahan : Larutan fiksatif (Formalin 10%)
• Cara Kerja :
1. Sampel jaringan yang dikirim dipilah-pilah menjadi 3 bagian:
Jaringan besar, sedang, dan kecil (ukuran <1 cm). Sampel jaringan
besar dan sedang dipotong dan diambil sebagian kurang lebih 1
cm x 1 cm. untuk sampel kecil langsung diproses selanjutnya.
2. Sampel jaringan yang telah dipotong dimasukkan ke dalam
cassette.
3. Cassette yang telah berisi jaringan dimasukkan ke dalam wadah
yang berisi larutan fiksasi.
4. Inkubasi pada suhu kamar minimal 24 jam.
5. Selanjutnya dilakukan proses dehidrasi.
• › Lamanya jaringan di dalam fiksatif tergantung pada
tebal jaringan, macam fiksatif (daya peresapannya) dan
konsistensi jaringan.

• › Pasca fiksasi, jaringan yang keras mendapat perlakuan

khusus, yaitu :
a. Tulang: dekalsifikasi (penyingkiran garam kalsium dalam
jaringan) dengan formic acid 8%  3 – 5 hari.
b. Kulit: teknik lendrum----cuci dengan air kran mengalir
atau alkohol 90% atau Fenol 4% dalam akuades
selama 1 -3 hari.
3. Dehidrasi
Proses pengeluaran air dari jaringan agar jaringan tersebut
dapat diisi oleh parafin sehingga dapat diiris tipis dan
membersihkan cairan fiksatif.

• Tujuan : Agar seluruh ruang-ruang antarsel dalam jaringan

dapat diisi dengan parafin. Dehidrasi menggunakan alkohol
bertingkat dari presentase rendah ke tinggi. Hal ini
dilakukan untuk menjaga agar tidak terjadi perubahan yang
tiba-tiba pada sel dan jaringan.
• Macam-macam Larutan Dehidrasi
1. Alkohol
2. Sukrosa
3. Metil Alkohol

› Konsentrasi awal ethanol yang digunakan untuk dehidrasi

tergantung kadar air cairan fiksatif. Misalnya apabila fiksatif
yang dipakai formalin 10 % maka dehidrasi dimulai dengan
ethanol 30 %, kemudian diteruskan dengan kadar yang
lebih tinggi sampai ethanol absolut (ethanol 100%).
› Lamanya dehidrasi tergantung pada volume jaringan.
Cara Kerja :
1. Siapkan wadah yang berisi bahan dehidrasi (Alkohol 30%,
50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%)
2. Sampel jaringan yang ada di wadah fiksasi dicuci dengan air
mengalir hingga bersih dari larutan fiksasi.
3. Masukkan sampel jaringan yang telah dicuci ke dalam wadah
yang berisi alkohol 30% selama 3 jam, yang mana setiap 1
jam sekali alkoholnya diganti.
4. Ambil sampel jaringan dari wadah yang berisi alkohol 30%
lalu dimasukkan ke dalam wadah yang berisi alkohol 40%
selama 3 jam, yang mana setiap 1 jam sekali alkoholnya
diganti.
5. Dst…. Sampai pada perendaman alkohol absolut.
6. Selanjutnya dilakukan proses Clearing.
4. Clearing / Pembeningan
Suatu tahap untuk mengeluarkan alkohol dari jaringan dan
menggantinya dengan suatu larutan yang dapat berikatan dengan
parafin.

Tujuan Clearing : Agar jaringan dapat dimasukkan ke dalam parafin.

Hal ini disebabkan larutan clearing dan parafin bisa saling melarutkan
dan yang menandai bahwa terjadi proses clearing adalah jaringan
tampak bening. Proses mengeluarkan alkohol dari jaringan ini sangat
krusial karena jika di dalam jaringan masih tertinggal sedikit alkohol,
parafin tidak bisa masuk ke dalam jaringan sehingga jaringan menjadi
“Matang di luar, Mentah di dalam” dan akan menyebabkan jaringan
menjadi sulit untuk dipotong dengan microtome.
• Macam-Macam Larutan Clearing
1. Xylol
2. Benzena
3. Kloroform
4. Cedarwood oil
5. Benzil Benzoat
6. Metil Benzoat

Cara Kerja:
1. Siapkan 2 wadah yang masing masing berisi larutan xylol I dan
xylol II.
2. Ambil jaringan dari proses akhir dehidrasi dengan menggunakan
pinset.
3. Masukkan ke dalam wadah xylol I selama 30 menit .
4. Jaringan diambil, dan masukkan ke dalam wadah xylol II selama
30 menit.
› Clearing dilakukan dengan xylol selama 30 menit sebanyak 2
kali karena pada perendaman xylol pertama kemungkinan
alkohol masih ada, sehingga dilakukan clearing pada xylol
kedua agar alkohol benar-benar tidak ada lagi pada organ.
• › Fungsi xylol adalah untuk menarik alkohol,
mempersiapkan bagian organ untuk pembenaman
(memasukkan parafin) karena xylol menyebabkan
sitoplasma kosong dan hanya terdiri bagian padat saja.
• › Yang perlu diperhatikan adalah perendaman tidak
boleh terlalu lama pada xylol karena dapat memberikan
warna kehitaman pada bagian organ.
5. Embedding/Impregnasi
(Pembenaman)
Impregnasi  proses pengeluaran cairan pembening (clearing
agent) dari jaringan dan menggantikannya dengan parafin atau
bahan plastik.

Tujuan dari impregnasi, yaitu agar jaringan benar-benar bebas

dari cairan pembening karena sisa cairan pembening dapat
mengkristal dan sewaktu dipotong dengan microtome akan
menyebabkan jaringan menjadi mudah robek.
Macam – Macam Zat Impregnasi
o Parafin cair panas. Parafin yang mencair pada suhu 56o-59oC.
o Paraplast. Campuran parafin murni dan beberapa polimer plastik.
o Plastik. Alternatif parafin termasuk sejumlah plastik yang
memungkinkan irisan yang lebih tipis. Plastik tersebut adalah metil
metakrilat, glikol metakrilat, araldit, dan epon.

Persiapan Melakukan Impregnasi

1. Alat :
o Wadah untuk tempat pemrosesan
o Pinset untuk ambil jaringan
o Pensil
o Label
o Inkubator

2. Bahan : Parafin cair

• Cara Kerja
1. Ambil jaringan dari proses akhir clearing
2. Masukkan jaringan ke dalam wadah yang berisi parafin cair
3. Masukkan ke dalam inkubator dengan suhu 56o-59oC.
4. Inkubasi minimal 2 jam.
6. Blocking (Pengecoran)
• Blocking adalah proses pembuatan blok parafin agar mudah
dipotong dengan microtome.
• Agar mudah diiris, jaringan dibentuk dan dikeraskan dengan parafin.
Alat pencetak dapat berupa besi berbentuk L (Leuckhart), atau
cetakan (mold) .

Alat : Cetakan (mold)

Bahan : Parafin cair
Cara kerja:
1. Ambil jaringan dari cassette
2. Tuangkan parafin secukupnya pada cetakan dan letakkan jaringan
pada dasar cetakan.
3. Hindarkan terbentuknya gelembung udara.
4. Diamkan hingga blok parafin menjadi keras.
5. Berilah label identitas jaringan.
7. Sectioning (Pemotongan Jaringan )
• Sectioning adalah pengirisan blok parafin dengan
microtome.

Alat :
1. Microtome
2. Watebath suhu 37-40oC
3. Kaca objek atau preparat yang telah diolesi dengan alat
perekat berupa putih telur (Albumin dan gliserin)
4. Sengkelit atau kuas
• Cara Kerja :

1. Jaringan yang terdapat dalam blok parafin dipotong dengan

alat potong mekanis (mikrotom), menjadi irisan-irisan yang
sangat tipis.
2. Tebal irisan biasanya antara 5-12 μ (1 mm = 1000 μ).
3. Pita parafin dimasukkan ke dalam waterbath menggunakan
sengkelit dengan suhu 370-400 yang tujuannya untuk menghilangkan
parafin dan mengembangkan potongan sehingga kerutan atau
lipatan dapat hilang.
4. Setelah pita parafin terkembang dengan baik, tempelkan pita
parafin tersebut pada preparat.
5. Setelah melekat, preparat digerakkan keluar dari waterbath
dengan hati-hati agar pita parafin tidak melipat.
6. Setelah kering dan pita parafin telah melekat kuat, simpan
preparat berisi potongan parafin dan jaringan sampai saatnya
diwarnai.
8. Deparafinisasi
Deparafinisasi  menghilangkan parafin yang masih
melekat pada preparat.

Cara Kerja : Preparat dimasukkan ke dalam Xylol I, Xylol II,

dan Xylol III masing-masing selama 5 menit.
 9. Staining (Pewarnaan)
• Staining adalah proses pemberian warna pada jaringan yang
telah dipotong sehingga unsur jaringan menjadi kontras dan
dapat dikenali/diamati dengan mikroskop.

• Tujuan staining, yaitu agar terjadi proses timbulnya warna

pada jaringan.

• Alat :
1. Preparat hasil sectioning
2. Staining jar

• Bahan :
1. Alkohol 100%, 95%, 90%, 80%, 70%
2. Larutan Mayer Hematoxikin
3. Larutan Eosin
4. HCl 0,4%
5. Xylol 1 dan xylol 2
6. Lithium Carbonat 5%
 Cara Kerja
1. Preparat dimasukkan ke dalam Larutan Alkohol secara bertahap dari
konsentrasi tinggi ke konsentrasi rendah : Larutan Alkohol 100% -> 95% ->
80% -> 70% selama masing-masing 3 menit
2. Preparat dibilas dengan air mengalir selama 3 menit
3. Preparat dimasukkan ke dalam Larutan Mayer Haematoxylin selama 5-10
menit untuk mewarnai inti sel
4. Bilas dengan air mengalir sampai warna biru hilang
5. Preparat dimasukkan ke Larutan HCL 0,4% 1-2 kali celup untuk melunturkan
warna di sitoplasma
6. Bilas dengan air mengalir
7. Preparat dimasukkan ke dalam Larutan Lithium Carbonat 5% selama 30 detik
untuk memperjelas warna inti
8. Bilas dengan air mengalir
9. Preparat dimasukkan ke dalam Larutan Eosin (counter stain) selama 1-2 menit
untuk mewarnai sitoplasma
10. Bilas dengan ethanol, sekaligus untuk dehidrasi dengan Larutan Alkohol 70%
 Larutan Alkohol 80%  Larutan Alkohol 95%  Larutan Alkohol 100%
selama masing-masing 3 kali celup
11. Lakukan penjernihan preparat dengan memasukkan ke dalam larutan Xylol I
dan Xylol II selama masing-masing 3 menit
Larutan Alkohol Bilas air Lar. Mayer Bilas air
Bertingkat 100% mengalir Hematoxylin 5-10 mengalir
-95%-80%-70% 3 menit menit sampai warna
3 menit u/ mewarnai inti biru hilang

Lar. Lithium Larutan HCL 0,4%

Carbonat 5% 30 1-2 kali celup
Bilas air Bilas air
detik mengalir u/ melunturkan
mengalir warna di stioplasma
u/ memperjelas inti

Larutan Eosin Dehidrasi: Lar Penjernihan : Larutan

(counter stain) Alkohol Xylol I dan Xylol II
selama 1-2 menit Bertingkat 70%
-80%-95%-100% 3 menit
u/ mewarnai
3 kali celup
sitoplasma
10. Mounting (Perekatan)
Mounting adalah Menempelkan potongan jaringan yang baik ke
objek glass.

Bahan : Canada Balsam/Entelan

Cara Kerja :
1. Letakkan 1 tetes Canada balsam diatas cover glass
2. lalu tutupkan ke atas kaca objek jangan sampai ada
gelembung udara
3. Observasi di bawah mikroskop
11. Labelling (Pelabelan)
• Labelling adalah pencatatan kembali dengan detail dari
jaringan pada gelas kaca atau preparat seperti nomor registrasi
pasien, nama organ, asal sampel, tanggal pembuatan, dan lain-
lain.

• Tujuan  untuk menghindari kesalahan atau tertukarnya

preparat satu dengan yang lainnya saat pengamatan oleh
dokter spesialis patologi anatomi.

• Bahan : Label dan Spidol

• Cara Kerja : Ambil preparat hasil pewarnaan  tulis label
sesuai dengan identitas pasien  tempelkan pada preparat.