PREPARASI SAMPEL UJI

IMUNOHISTOKIMIA
OLEH:
HIJRAL ASWAD, S.Si.M.Kes.
SPESIMEN UJI HISTOKIMIA
 Spesimen dapat berupa jaringan atau organ yang
disimpan pada suhu -80 derajat celcius

 Sediaan specimen dapat dibuat secara histopatologi

berbentuk blok paraffin

 Blok Parafin dipotong dengan mikrotom ketebalan sekitar

5 micron (Ukuran optimal untuk uji imunohistokimia)
FIKSASI SEDIAAN JARINGAN
IMUNOHISTOKIMIA
 Fiksasi adalah proses pengawetan sel, jaringan atau organ
agar tetap menyerupai keadaan fisiologis normalnya.
 Senyawa yang digunakan; Senyawa kimia fiksatif
 Keberhasilan fiksasi untuk aplikasi imuhistokimia
ditentukan oleh jenis senyawa kimia fiksatif dan lama
waktu fiksasi sediaan
MANFAAT PROSES FIKSASI SEDIAAN
 Mencegah otolisis jaringan
 Menghambat pertumbuhan bakteri dan jamur pada
jaringan
 Menstabilkan sediaan sehingga tidak mudah rusak dan
terlepas pada saat uji imunohistokimia
 Mengawetkan sel dan jaringan dengan mengkoagulasi
protein jaringan dan meng-inaktivasi enzim
PERMASALAHAN UTAMA PROSES
FIKSASI
 Kemungkinan terbentuknya artefak (kotoran) akibat
adanya perubahan komposisi kimiawi
 Perubahan fisik komponen intraselular dan
ekstraselular
 Kerusakan membrane non-permeable yang
membungkus sel
 Jenis senyawa fiksatif dan waktu fiksasi harus sesuai
terhadap sediaan jaringan dan antigen sasaran
PREPARAT APUS SEL
 Jika berasal dari cairan sekresi dan ekskresi tubuh;
metode apus tunggal (sediaan apus tipis)

 Jika terlalu tebal (sediaan apus tebal) terjadi, maka

terjadi distribusi senyawa kimia pewarna
(Kromogenik) dan mengganggu interpretasi hasil
pengamatan
 SEDIAAN APUS DARAH
 Sebelum fiksasi, sediaan apus darah harus dikeringkan
secepat mungkin pada suhu kamar, untuk mencegah
kerusakan pada morfologi sel

 Pengeringan apus darah berfungsi menjaga specimen tetap

utuh selama proses uji imunohistokimia
Keuntungan Dan Kelemahan Pengeringan
Suhu Kamar
 Keuntungan: Sel-Sel melekat lebih kuat

 Kelemahan: Hasil pewarnaan imunohistokimia relative lemah,

karena adanya pengerutan sel yang menjadi kering sehingga
menghasilkan densitas antigen yang lebih rendah
 Solusi: Dilakukan perpanjangan waktu inkubasi sediaan apus
dengan antibody atau pewarna (kromogen), pengaplikasian uji
imunohistokimia yang lebih sensitif
Jenis Senyawa Kimia Fiksatif Untuk Apus
Darah
 Methanol; pewarnaan efektif untuk pewarnaan rutin
sediaan apus darah dengan pewarna tipe Romanowsky
 Aseton; Paling tepat untuk fiksasi Leukosit
 Campuran aseton formal; Fiksasi Leukosit, terutama
limfosit
 Formalin; Fiksasi sitoplasma dan membrane sel
 Fiksatif yang dianggap paling sesuai untuk pemeriksaan
sediaan jaringan melalui uji imunopatologis
imunohistokimia adalah Larutan Pelly dan periodat Lisin-
paraforaldehid. Merupakan fiksatif yang di anggap paling
sesuai untuk fiksasi antigen intrasitoplasmik
Prosedur Fiksasi Sediaan Darah Apus
 Apusan darah dibuat pada preparat yang bersih dan tidak berminyak
 Apusan dikeringkan pada suhu kamar (hingga berwarna putih)
 Lakukan fiksasi apus darah dengan cara direndam dalam senyawa
kimia fiksatif yang sesuai (5-10 menit)
 Selanjutnya di keringkan dan dilanjutkan untuk uji imunohistokimia

*Jika tidak langsung diuji imunohistokimia, sediaan apus darah

dapat disimpan pada suhu 4 derajat celsius
Pembuatan Apusan Darah
Apusan Darah
Apus Darah
SEDIAAN APUS SITOLOGI
 Fiksasi Basah; Sampel di fiksasi segera setelah dibuat sediaan apus
dapat dilakukan dengan Etanol 95%

 Manfaat Fiksasi Basah; dapat mengawetkan struktur kromatin dan

mempermudah evaluasi perubahan yang mungkin ada pada nucleus

 Masa inkubasi Fiksasi Basah: Sebaiknya di perpendek sesingkat

mungkin, tetapi digunakan antibody konsentrasi tinggi ataupun
dengan meningkatkan suhu inkubasi
Prosedur Fiksasi Sediaan Apus Sitologi
 Setelah sediaan apus sitology dibuat, rendam
(fiksasi) sediaan apus sitology dalam Etanol 95%
selama 10-15 menit

 Keringkan pada suhu Kamar

 Selanjutnya cuci dengan Etanol Absolute, Etanol

70% dan H2O sebelum diwarnai imunohistokimia
Peran Etanol Dalam uji Imunohistokimia
 Etanol mampu menfiksasi secara cepat dan memberikan
pengawetan sitology yang baik
 Mengawetkan jaringan dengan cara koagulasi tanpa membentuk
senyawa sampingan
 Merupakan larutan koagulan, penetrasi antibody pada jaringan
sempurna dan imureaktivitas epitope tidak mengalami kerusakan
 Etanol mempresipitasi karbohidrat, sehingga bermanfaat untuk
fiksasi sel dan jaringan dan membantu mendeteksi antigen
membrane permukaan yang mempunyai Epitop mengandung
Karbohidrat
Metode Papanicolau
 Dikenal juga dengan pewarnaan PAP

 Dikembangkan oleh George Papanicolaou pada tahun

1942

 Merupakan teknik pewarnaan Multikromatik (beraneka

warna)

 Pewarnaan PAP di gunakan untuk membedakan sel

dalam sediaan apus
 Metode Papanicolau Pada Apus Sito
 Preparat apusan dicelupkan sebanyak 5 kali dalam alcohol 80%, 70%, 50%
 Bilas dengan air mengalir
 Preparat di masukkan ke dalam harris hematoxilin selama 5 menit, lalu di bilas dengan air
mengalir selama 5 kali celup
 Preparat dicelup sebanyak 1 kali ke dalam HCL 0,5%, lalu bilas dengan air mengalir sebanyak 3
kali celup
 Celupkan preparat sebanyak 5 kali ke dalam alkohol 50%, 70%, 80%, 95%
 Rendam preaparat ke dalam larutan Orange-G selama 3 menit
 Preparat di celupkan sebanyak 5 kali ke dalam alcohol 95%
 Rendam preparat dalam larutan EA-50 selama 3 menit
 Celupkan preaparat sebanyak 5 kali ke dalam alcohol 95%
 Rendam preparat dalam alcohol 100% selama 1 menit Oranye-G
 Rendam kembali preparat dalam Xilol I dan II selama 2 menit
 Sediaan di keringkan dan ditutup dengan deckglass
Sel Melanoma Liver
Cara Pewarnaan Apusan Sitologi Yang
Telah Diwarnai dengan Papanicolau
 Gelas penutup di lepas dengan cara di celupkan ke dalam
xilen
 Cuci 3-5 kali dengan xilen
 Cuci dengan Ethanol absolute 2 kali
 Rendam apusan sitology ke dalam larutan campuran
Hidrogen Peroksida/Metanol (Hidrogen Peroksida 3%
dalam Metanol absolut)
 Lanjutkan dengan pewarnaan uji Imunohistokimia
SEKIAN DAN TERIMAKASIH