APLIKASI UJI

IMUNOHISTOKIMIA
Oleh:
Hijral Aswad, S.Si. M.Kes.
Pendahuluan
 Proses diagnostic dapat dilakukan dengan
antibody monoclonal dan antibody poliklonal

 Uji immunohistokimia; dapat menentukan ada

atau tidaknya hubungan antara agen penyebab
penyakit dengan struktur sel atau jaringan,
sehingga dapat diidentifikasi dan ditentukan sel
sasaran yang dimaksud dan distribusi selular lesi
patologis
Manfaat Analisis Imunohistokimia
 Perbandingan hasil pemeriksaan histopatologi dan
imunohistokimia sebagai etiologis penyakit terkait
 Memungkinkan penggunaan specimen yang lebih sedikit
 Dapat mendeteksi antigen pada seluruh bagian jaringan
tertentu
 Reaksi cukup sensitive untuk identifikasi infeksi local
 Sangat bermanfaat dalam pemahaman pathogenesis
penyakit
 Membantu membedakan antara antigen dan artefak
 Identifikasi ketepatana asal jaringan yang diperiksa
Methode Diagnostik Imunohistokimia
Peroksidase-Antiperoksidase (PAP)
AlkalinFosfatase-Antialkalin
Fosfatase (APAAP)
Komplek Avidin-Biotin (ABC)
Streptavidin-Biotin (SB)
Peroksidase-Antiperoksidase
(PAP)
 Enzim yang di konjugasikan pada antibody dapat
mengidentifikasi antigen spesifik dalam specimen
jaringan

 Adanya antigen dapat diketahui dengan adanya

ikatan antara antibody dengan antigen target
yang terlihat di bawah mikroskop sebagai endapan
(Presipitat) yang berwarna merah kecoklatan.
Macam Uji PAP
 Uji PAP tidak Langsung
 Uji PAP Langsung

Pada Uji PAP, sediaan jaringan diberi

antibody (anti-antigen spesifik yang di
kehendaki) yang dilabel enzim (horseradish
peroksidase) dan diinkubasi selama waktu
tertentu
Uji PAP Tidak Langsung
 Antigentarget yang terikat pada antibody spesifik
(Antibodi Primer), akan terdeteksi melalui
penambahan antibody Sekunder anti-antibody
primer yang dilabel enzim, substrat, dan
kromogen

 Pada pemeriksaan dibawah mikroskop, adanya

warna merah kecoklatan. Menunjukkan adanya
antigen yang terdapat pada jaringan
Uji PAP Langsung
 Sediaan jaringan diinkubasi terlebih dahulu
dengan antibody Primer (Anti-Antigen Target)—
Antigen Spesifik.
 Sediaan jaringan, ditambah antibody Sekunder
(dari spesies berbeda, yang memiliki spesifitas
terhadap antibody Primer), anti-antibody primer
dan konjugat yang merupakan kompleks antibody-
anti-antibody sekunder yang dilabel enzim
peroksidase atau disebut juga komplek PAP
  Sediaan Jaringan;
 Antibodi Primer;
Spesifik

 Antibodi Sekunder;

 Konjugat; Kompleks PAP

Inkubasi Kromogen
Enzim
Peroksidase

Enzim akan mengkatalisis substrat dan mengubah Kromogen menjadi endapan

yang berwarna (bergantung pada jenis kromogen yang digunakan). Untuk Substrat
dapat digunakan Hidrogen Perosida (H2O2), Sedangkan Kromogen dapat
digunakan 3,5’-diaminobenzidin (DAB)
Jenis Kromogenik Pada Uji
Immunohidtokimia PAP
 3,5’-diaminobenzidin (DAB); Kromogen Utama,
memberikan produk endapan berwarna kecoklatan
 Alfa-naftol pironin; memberikan produk kromogenik
berwarna merah terang
 3-amino-9-etilkarbazol; memberikan produk kromogenik
berwarna merah
 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidin; menghasilkan produk
kromogenik berwarna coklat menyerupai produk
kromogenik DAB
Kelebihan Uji PAP
 Antigen pada sediaan jaringan dapat di
amati di bawah mikroskop cahaya dengan
cepat, tepat, dan akurat
 Sediaan terwarnai sedemikian rupa
sehingga hubungan antara struktur sediaan
dapat di amati dengan mudah
 Sediaan yang telah tewarnai dapat
disimpan secara permanen
Kelebihan Uji PAP
 Uji PAP dapat diadaptasikan untuk
pemeriksaan ulang sediaan jaringan
mikroskop electron transmisi
 Dapat diaplikasikan untuk pemeriksaan
ulang sediaan jaringan fiksatif formalin
yang di blok parafin yang telah tersimpan
lama.
Kekurangan Uji PAP
 Jika sedikit antigen pada sediaan jaringan yang
tewarnai positif, maka hasil pewarnaan
imunohistokimia pada uji PAP sulit diamati dengan
miikroskop cahaya
 Ada kemungkinan enzim endogen peroksidase
tidak tereliminasi secara se
 mpurna dari sediaan jaringan yang di periksa
 Produk hasil reaksi enzimatis imunologis dapat
berdifusi keluar sel atau jaringan yang merupakan
lokasi antigen
Prosedur Uji Imunohistokimia PAP

FiksasiJaringan atau organ

Deparafinisasi Sediaan Jaringan
Rehidrasi Sediaan Jaringan
Pewarnaan PAP
Fiksasi Jaringan Atau Organ
 Jenis fiksatif yang digunakan adalah;
1. Neutral buffered formalin 10%
2. Zenker
3. Fiksatif B5 yang mengandung merkuri
4. Bouin
5. Fiksatif PLP
Fiksasi Jaringan/organ
 Fiksasi jaringan atau organ dalam formalin selama
12 jam
 Untuk sediaan potong beku dapat di fiksasi
dengan aseton, glutaraldehid, dan
paraformaldehid
 Jenis fiksatif yang digunakan kadang tergantung
jenis antigen yang akan diidentifikasi
 Hasil Uji PAP Tidak baik jika;
1. Jaringan atau organ telah autolysis
2. Waktu fiksasi berlebihan atau kurang
3. Fiksatif asam non buffer
4. Pemanasan berlebihan saat pemrosesan
jaringan atau organ
5. Bahanpeng-blokan jaringan atau organ
berlebihan
Deparafinisasi Sediaan Jaringan

Sediaan jaringan dimasukkan ke dalam Xilen

tiga kali, masing-masing selama 2 menit
Rehidrasi Sediaan Jaringan
 Sediaan jaringan dimasukkan secara berturut-
turut;
1. Etanol absolut sebanyak 2 kali, masing-masing 2
menit
2. Etanol 95%, 1 kali selama 2 menit
3. Etanol 50%, 1 kali selama 2 menit
4. Aquades, 2 kali masing-masing selama 2 menit
Prosedur Fiksasi Pada Sediaan Beku
 Sediaan dibiarkan kering terlebih dahulu
 Difiksasi dengan Aseton pada suhu kamar, selama 5 menit
 Dikeringkan kembali pada suhu kamar selama 45 menit,
sebelum uji imunohistokimia

 Jika tidak langsung di uji PAP, sediaan tadi dibungkus

almunium foil dan disimpan pada suhu -700C atau lebih
rendah
 Selanjutnya sebelum dilakuan uji imunohistokimia, semua
sediaan beku jaringan dibiarkan dulu pada suhu kamar
sekitar 1 jam
Pewarnaan PAP
 Sebelum sediaan jaringan diberi antibody primer, aktivitas
peroksidase endogen dihambat; sediaan direndam dengan
Working Block Reagent. Waktu yang dibutuhkan bervariasi
o Untuk sediaan potong beku, sediaan sitospin jaringan, dan
sediaan apus darah: 45 detik
o Untuk sediaan sentuh; 1 menit
o Untuk sediaan Blok parafin histopatologi jaringan: 4 menit
 Cuci bersih sediaan jaringan yang menempel pada gelas
benda dengan aquades
 Inkubasi dengan antibody primer anti-antigen target pada
suhu 370C selama 30 menit atau pada suhu kamar selama 45
menit
 Inkubasi sediaan jaringan dengan
peroxidase labeled reporter system
 Cucisediaan jaringan dengan PBS 0,01 M
atau Tris-HCl pH 7,2-7,8 selama 10 menit
 Persiapkan larutan substrat, misalnya;
HistoMark Orange atau HistoMark Blac
Prosedur Pembuatan Larutan Substrat
Uji PAP
 Siapkan 5 ml aquades, tambahkan 0,5 ml larutan buffer
Enhance Orange atau Enhance Black
 Tambahkan 0,1 ml larutan DAB-C atau DAB
 Selanjutnya tambahkan larutan peroksida 0,1 ml
 Homogenkan larutan dengan baik, segera sebelum
campuran digunakan
Pewarnaan PAP (Lanjutan)
 Cuci sediaan jaringan dengan PBS dan keringkan
 Beri sediaan jaringan dengan 300-400 µl larutan substrat yang
telah dibuat
 Inkubasi pada suhu kamar selama 10 menit dan hindarkan dari
cahaya
 Setelah inkubasi 10 menit, cuci sediaan jaringan dengan air
mengalir selama 2-3 menit
 Tetesi sediaan jaringan dengan larutan dasar Contrast Green.
Untuk sediaan blok parafin jaringan dan potong beku selama 3
menit. Untuk sediaan sentuh, cytospin, atau sediaan apus
darah 30-45 menit
Lanjutan Prosedur Pewarnaan PAP

 Cuci bersih sediaan jaringan dengan air mengalir

 Berikan larutan perekat xilen pada sediaan
jaringan
 Amati sediaan jaringan di bawah mikroskop
SEKIAN DAN TERIMAKASIH