APLIKASI ENZIM

PROTEOLITIK PADA SEDIAAN

UJI IMUNOHISTOKIMIA
Oleh: Hijral Aswad, S.Si.M.Kes.
Pendahuluan
◦ Enzim Proteolitik; Enzim yang mampu menghidrolisis senyawa
protein
◦ Beberapa enzim proteolitik, bermanfaat ; meningkatkan
imunoreaktivitas sediaan jaringan yang di blok parafin untuk uji
imunohistokimia

◦ Contoh enzim proteolitik: Tripsin, Pepsin, Pronase

◦ Sebelum pengaplikasian enzim proteolitik, dilakukan metode
deparafinisasi terhadap Blok Parafin
Prosedur Aplikasi Enzim Proteolitik
Tripsin
◦ Setelah deparafinisasi, di lakukan rehidrasi pada sediaan jaringan
dengan ketebalan ± 5 µ yang telah menempel pada gelas benda
◦ Jika perlu, dilakukan penghambatan aktivitas peroksidase endogen
dengan pemberian Hidrogen Peroksida (H2O2)
◦ Sediaan jaringan pada gelas benda dicuci dengan aquades
◦ Selanjutnya di cuci kembali dengan Tris-buffered saline pH 7,6
selama 5 menit
◦ Inkubasi sediaan jaringan pada gelas benda dengan Tripsin 0,1% :
Kalsium Klorida 0,1% : dan tris-buffered saline pada suhu 370C
selama 30 menit.

Hangatkan larutan buffer terlebih dahulu dan tambahkan enzim

proteolitik segera sebelum di gunakan pada sediaan jaringan
◦ Cuci sediaan jaringan pada gelas benda dengan Tris-
buffered saline pH 7,6 sebanyak 3 kali, masing-
masing selama 1-2 menit pada suhu kamar

◦ Selanjutnya di akhiri dengan pewarnaan

imunohistokimia
Prosedur Aplikasi Enzim Proteolitik
Pepsin
◦ Lakukan deparafinisasi dan rehidrasi pada sediaan jaringan dengan
ketebalan ± 5 µ yang sudah menempel pada gelas benda
◦ Jika diperlukan, dilakukan penghambatan aktivitas peroksidase endogen
dengan pemberian hydrogen peroksida (H2O2)
◦ Cuci sediaan jaringan pada gelas benda dengan aquades dan kemudian
cuci kembali dengan HCl
◦ Inkubasi sediaan jaringan pada gelas benda dengan Pepsin 0,4%
yang terlarut dalam 0,01 M HCl pada suhu 370C
◦ Cuci sediaan jaringan pada gelas benda dengan aquades selama 2
menit
◦ Cuci sediaan jaringan dengan buffer
◦ Selanjutnya, dilakukan pewarnaan imunohistokimia
Prosedur Aplikasi enzim proteolitik
Pronase
◦ Lakukan deparafinisasi dan rehidrasi pada sediaan jaringan dengan ketebalan ± 5 µ yang sudah
menempel pada gelas benda
◦ Jika perlu, dilakukan penghambatan terhadap aktivitas Peroksidase Endogen dengan pemberian hydrogen
peroksida (H2O2)
◦ Sediaan jaringan pada gelas benda dicuci dengan aquades dan kemudian dicuci kembali dengan Tris-
buffered saline pH 7,6 selama 5 menit
◦ Inkubasi sediaan jaringan pada gelas benda dengan Pronas 0,1 % yang terlarut dalam 0,05 M Tris-
buffered saline (pH 7,6) selama 15 menit pada suhu 370C
◦ Cuci sediaan jaringan pada gelas benda dengan Tris-buffer dingin selama 5 menit
◦ Selanjutnya, lakukan pewarnaan imunohistokimia
Faktor Yang Mempengaruhi Waktu
Digesti
◦ Jenis senyawa enzim proteolitik yang di gunakan
◦ Konsentrasi Senyawa enzim proteolitik
◦ Suhu enzim proteolitik
◦ Lama waktu Fiksasi pada sediaan jaringan

Efektifitas enzim proteolitik bergantung pada jenis senyawa

fiksatif yang digunakan pada sediaan jaringan
Jenis Senyawa Fiksatif
◦ Jika berbahan dasar formaldehid; Efektifitas enzim proteolitik
umumnya lebih baik
◦ Jika bersifat koagulatif misalnya aseton atau etanol; Efektifitas
enzim proteolitik kurang baik
◦ Jika digunakan fiksatif campuran Merkuri Klorida (koagulatif) dan
Formalin---Fiksatif B5; Hasil fiksasi akan baik pada sediaan
jaringan
Kinerja Enzim Proteolitik
◦ Enzim proteolitik juga hanya efektif untuk kombinasi antigen dan antibody tertentu
◦ Contoh; ikatan antibody monoclonal dengan antigen. Jika epitope rusak pada sisi yang di
kehendaki antibody akibat penambahan senyawa fiksatif, maka pemberian enzim proteolitik
tidak berguna
◦ Pada kasus tertentu, reaktivitas antibody poliklonal terhadap antigen, misalnya neuron-spesifik
enolase; dapat rusak akibat penambahan enzim proteolitik
◦ Ada baiknya dilakukan uji coba terlebih dahulu pada setiap antibody poliklonal ataupun
monoclonal baru dengan atau tanpa enzim proteolitik pada sediaan jaringan untuk uji
imunohistokimia
◦ Untuk optimasi waktu fiksasi sediaan jaringan denga fiksatif, dilakukan
evaluasi kondisi hidrolisis optimum enzim proteolitik terhadap sampel dengan
waktu fiksasi yang berbeda sebelum uji imunohistokimia

◦ Contoh; Tripsin, Inkubasi sejumlah sediaan jaringan pada gelas benda dalam
larutan enzim proteolitik dengan perbedaan waktu 5 menit. Jika diwarnai
dengan pewarnaan rutin hematoksilin-eosin, maka terlihat adanya beberapa
perubahan gambaran morfologi sel. Jika sitoplasma atau morfologi nucleus
tidak jelas, maka terjadi hidrolisis berlebihan oleh enzim proteolitik pada
sediaan jaringan. Sehingga dapat dilakukan pengurangan waktu
Saran;
◦ Jika sediaan jaringan terhidrolisis sama sekali oleh enzim proteolitik,
Sebaiknya dilakukan Pengenceran dari pada memperpendek waktu inkubasi.
Sehingga hasil uji imunohistokimia dapat terkontrol dengan baik

◦ Untuk menanggulangi digesti berlebihan dari enzim proteolitik, dapat

dilakukan dengan cara mengubah waktu inkubasi untuk menurunkan ataupun
meningkatkan efisiensi digesti
Deparafinisasi
◦ Adalah proses penghilangan parafin pada sediaan jaringan untuk uji
imunohistokimia
◦ Menjernihkan jaringan dari berbagai komponen
◦ Prosedur:
1. Sediaan jaringan di masukkan dalam xilen 3 kali, masing-masing selama 2 menit
2. Sediaan jaringan ataupun sediaan apus sel, kemudian di cuci dengan buffer fosfat
selama 10 menit

Yang perlu diperhatikan, Sediaan jaringan tidak boleh kering selama

berlangsungnya proses pewarnaan imunohistokimia
Rehidrasi
◦ Masukkan sediaan jaringan ke dalam Etanol absolute sebanyak 2 kali, masing-
masing 2 menit
◦ Masukkan sediaan jaringan ke dalam Etanol 95% sebanyak 1 kali selama 2
menit
◦ Masukkan sediaan jaringan ke dalam Etanol 50% sebanyak 1 kali selama 2
menit
◦ Masukkan sediaan jaringan ke dalam aquades sebanyak 2 kali, masing-masing
selama 2 menit
SEKIAN DAN TERIMAKASIH