ISOLASI DAN AMOBILISASI PROTEASE DARI TEMPE

Oleh: nancy sd

I. PENDAHULUAN

Protease adalah enzim pengurai protein yang telah diproduksi secara komersial.
Protease banyak digunakan dalam industri bioproses antara lain industry deterjen dan industry
makanan dan minuman seperti susu, mentega dan keju. Protease dapat diperoleh dari berbagai
macam makanan, tumbuhan dan mikroorganisme. Tempe, nenas dan getah papaya adalah
bagian dari sumber penghasil protease.

Protease dapat diisolasi dengan dengan menggunakan metode ekstraksi dingin. Untuk
meningkatkan aktifitasnya, protease dimurnikan dengan metode fraksinasi menggunakan
ammonium sulfat. Sedangkan untuk uji aktivitas protease dapat dilakukan dengan metode
Kunizt dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang maksimum ( max)
280 nm.

Untuk memaksimalkan penggunaan protease didalam bioproses maka dilakukan teknik

amobilisasi dengan metode penjeratan (entrapping). Dengan demikian enzim ini dapat
digunakan berulan-ulang dan akifitasnya dapat dipertahankan.

ll. Latar Belakang

Tempe merupakan makanan asli Indonesia yang banyak digemari karena mengandung
berbagai macam gizi diantaranya 19,5 % protein (Shurtleff and Aoyagi , 2009). Tempe
merupakan makanan hasil fermentasi kedelai dengan jamur Rhizopus. Tempe mengandung
berbagai macam enzim, diantaranya protease. Protease merupakan biokatalisator yang pada saat
ini sudah diproduksi secara komersial dan digunakan dalam industry kulit, detergen, pangan
dan produk-produk biomedis dan kosmetik.

Peningkatan penggunaan protease dapat dipenuhi antara lain dari tempe. Produksi
protease dari tempe yang dilakukan secara secara tradisional masih jarang dilakukan karena
isolasinya memerlukan teknik tersendiri untuk menghindari penurunan aktifitas dari enzim
tersebut. Suatu cara untuk menjaga aktivitas suatu enzim yaitu melalui teknik amobilisasi.
Teknik amobilisasi enzim adalah suatu cara dimana enzim secara fisik dibatasi atau dilokalisasi
dalam ruang tertentu.

Enzim atau protein merupakan makromolekul yang berbeda ukuran, kelarutan, muatan
dan bentuknya. Berdasarkan sifat ini maka dapat dilakukan pemurnian enzim diantaranya
menggunakan metode fraksinasi/pengendapan dan dialysis.

PRAKT.BIOTEKNOLOGI 1
Tujuan Percobaan :

1. Melakukan isolasi dan amobilisasi protease dari tempe melalui proses ekstraksi dingin
2. Mendapatkan kondisi lingkungan (temperature dan pH optimum) untuk aktivitas
protease sebelum dan sesudah amobilisasi.

lII. LANDASAN TEORI

Enzim merupakan senyawa protein yang mengkatalisis seluruh proses biokimiawi dalam
sel hayati yang sangat spesifik dan efektif. Enzim dapat dipisahkan dari sel-sel yang
menghasilkannya dan dapat melaksanakan aktivitasnya di luar sel. Sesuai dengan perkembangan
teknologi, saat ini enzim juga merupakan suatu produk fermentasi dan telah diproduksi secara
besar-besaran di industry.
Enzim digunakan dalam dunia industry dalam volume yang besar. Beberapa enzim yang penting
, yaitu :

1. Enzim yang menghidrolisis karbohidrat

2. Enzim yang menguraikan lemak dan minyak
3. Enzim yang menguraikan protein, dll.

Salah satu enzim pengurai protein yaitu protease yang dapat diisolasi dari tempe .
Pemanfaatan prote ase dari bakteri masih belum banyak, sedangkan dari jamur sudah lebih maju
dan diproduksi secara komersial . Ciri penting yang membedakan protease adalah pH
optimumnya. Berdasarkan pH optimumnya protease terdiri dari 3 jenis yaitu protease basa,
protease netral dan protease asam.

Enzim dalam melakukan aktivitasnya dipengaruhi oleh lingkungannya, yaitu

temperature, pH, kadar air dan kadar garam. Berikut ini dijelaskan pengaruhnya terhadap
aktivitas enzim.

a. Pengaruh temperature tinggi :

Pada umumnya semakin tinggi temperature, maka akan semakin naik laju reaksi kimia baik
yang dikatalisis maupun yang tidak oleh enzim. Tetapi harus diingat bahwa enzim adalah
protein, jadi semakin tinggi temperature proses inaktivasi enzim juga meningkat. Keduanya
mempengaruhi laju reaksi enzimatik secara keseluruhan. Hamper semua enzim mempunyai
aktivitas optimum pada temperature sekitar 30oC dan denaturasi mulai terjadi pada temperature
45oC (Winarno, F.G, 1996).

PRAKT.BIOTEKNOLOGI 2
 b. Pengaruh temperature pembekuan :

Beberapa enzim dapat terdenaturasi pada suhu pembekuan, tetapi sebagian enzim masih
bertahan dalam keadaan ini. Beberapa enzim dapat mengalami kerusakan bila dibiarkan pada
temperature rendah bukan beku (chilling) . Keadaan tersebut dikenal dengan nama denaturasi
dingin.

c. Pengaruh pH :

Perubahan aktivitas enzim akibat perubahan pH lingkungan disebabkan terjadinya

perubahan ionisasi enzim, substrat atau kompleks enzim substrat. Enzim menunjukkan aktivitas
maksimum pada kisaran pH yang disebut pH optimum yaitu antara pH 4,5 – 8,0 (Winarno,F.G,
1986). Suatu enzim tertentu mempunyai kisaran pH optimum yang sangat sempit. Di sekitar pH
optimum enzim mempunyai kestabilan yang tinggi.

d. Pengaruh kadar air dan water activity, (Aw) :

Kadar air dari bahan sangat mempengaruhi laju reaksi enzimatik. Pada kadar air bebas yang
rendah terjadi rintangan sehingga baik difusi enzim atau substrat terhambat. Akibatnya hidrolisis
hanya terjadi pada bagian substrat yang langsung berhubungan dengan enzim.
Dalam system reaksi enzim, kadar air mutlak bukan merupakan factor yang penting, tetapi
aktivitas enzim lebih banyak dipengaruhi oleh water activity (Aw) bahan dan kelembaban udara
disekitarnya. Pada Aw rendah hanya sebagian kecil substrat terlarut dalam air bebas. Setelah
substrat tersebut habis dihidrolisis, maka reaksinya terhenti. Dengan meningkatkan kelembaban
udara, jumlah air bebas akan meningkat dan dapat melarutkan substrat sehingga reaksi dimulai
kembali.

e. Pengaruh kadar garam :

Berdasarkan lokasinya , enzim dapat dibedakan dalam 2 golongan, yaitu endoenzim dan
eksoenzim. Kadar elektrolit yang tinggi umumnya mempengaruhi kelarutan protein. Dengan
demikian garam sering digunakan untuk melarutkan beberapa jenis protein dan enzim (salting in)
sebaliknya dapat pula digunakan untuk mengendapkan protein atau enzim (salting out). Dalam
hal ini salting out dapat dimanfaatkan untuk mengisolasi enzim.
Berdasarkan lokasinya enzim dapat dibedakan dalam 2 golongan yaitu, endo enzim
(intraselular) yaitu enzim yang bekerja di dalam sel, sedangkan eksoenzim (ekstraselular) adalah
enzim yang dikeluarkan dari sel dan terdapat bebas dalam media dan mengelilingi sel.

Berbagai teknik isolasi enzim yang sering digunakan antara lain :

1. Homogenisasi, merupakan pemampatan sel melalui celah yang sempit sehingga dinding
sel akan pecah akibat tekanan dan gesekan. Homogenisasi jaringan tumbuhan atau
hewan untuk keperluan isolasi enzim dapat dilakukan dengan berbagai macam alat yang
disebut homogenisator.
PRAKT.BIOTEKNOLOGI 3
 2. Sentrifugasi, untuk memisahkan endapan dari suatu suspense sering digunakan teknik
sedimentasi yang dikenal sebagai sentrifugasi. Teknik ini banyak digunakan dalam isolasi
enzim karena cepat, mudah dan lebih baik pemisahannya daripada penyaringan. Setelah
dilakukan sentrifugasi maka diperoleh endapan atau residu. Di bagian atas terdapat
larutan jernih yang disebut supernatant. Namun demikian pada sentrifugasi sering
timbul panas yang menyebabkan kenaikan suhu pada suspensi, sehingga enzim yang
terkandung dapat terdenaturasi . Sehingga peralatan sentrifugasi ini dilengkapi dengan
alat pendingin yang dapat mempertahankan temperature pada 2-4 oC.
Enzim atau protein merupakan makromolekul yang berbeda ukuran, kelarutan, muatan dan
bentuknya. Berdasarkan sifat ini maka dapat dilakukan pemurnian enzim , antara lain :
a. Pemisahan berdasarkan ukuran dengan sentrifugasi gradient densitas
b. Kromatografi ekslusi atau filtrasi
c. Pengendapan (fraksinasi), yaitu pengendapan dengan aseton, garam, dan asam
d. Dialisis
e. Kromatografi kolom

Aktivitas enzim dapat ditentukan secara kualitatif dengan reaksi kimia yaitu dengan
substrat yang dapat dikatalisis oleh enzim tersebut. Secara kuantitatif ditentukan dengan
mengukur laju reaksi tersebut.
Uji aktivitas enzim protease dapat dilakukan dengan menggunakan metode Kunitz yang
diukur secara spektrofotometri UV/VIS pada panjang gelombang maksimum 280 nm. Satu Unit
aktivitas protease adalah aktivitas protease yang dapat menyebabkan perubahan serapan 0,001
pada kondisi percobaan 37oC, pH 8 dengan waktu inkubasi 15 menit.
Aktivitas enzim dengan metode Kunitz dapat dihitung dengan menggunakan rumus :

As− Ak 1
Aktivitas enzim = . . Pengenceran
0,001 t

Keterangan :
As = Absorbansi sampel
Ak = Absorbansi blanko
t = waktu inkubasi

Amobilisasi enzim adalah proses dimana enzim ditempatkan dalam suatu ruang tertentu
atau terikat secara fisik (terlokalisasi) pada suatu tempat tetapi masih mempunyai aktivitas
katalitik. Manfaat dari amobilisasi ini adalah enzim amobil tersebut dapat digunakan berulang-
ulang .

Amobilisasi enzim dapat diklasifikasikan dalam 3 kategori, yaitu :

1. Metode pengikatan enzim pada bahan pendukung yang tidak larut dalam air

PRAKT.BIOTEKNOLOGI 4
 2. Metode ikatan silang antara enzim dengan pereaksi bergugus fungsi ganda atau
bergugus fungsi banyak
3. Metode penjeratan yaitu penjeratan enzim ke dalam kisi-kisi gel polimer
semipermiable (entrapping).

IV. PERCOBAAN

Bahan dan Alat yang digunakan

Bahan yang digunakan :

Tempe segar
Larutan buffer phosphate pH 7
Aquadest
Ammonium sullfat
Larutan buffer tris HCl 0,002M pH 8
Ba Cl2
Kasein 1 %
TCA 10%
Larutan buffer tris HCl 0,05M pH8
Na-alginat
CaCl2 2%
Larutan buffer tris HCl dengan pH bervariasi

Alat yang digunakan :

Blender
Corong pisah
Corong gelas
Erlenmeyer
Kertas saring
Lemari pendingin
Centrifuge dingin
Stirrer
Hot plate
Gelas kimia
Kantung cellophane
Erlenmeyer 1000 ml
Water bath
Termometer

PRAKT.BIOTEKNOLOGI 5
 Inkubator
Stopwatch
Spektrofotometer UV/VIS
Seperangkat tabung reaksi
Vortex
Suntikan/syringe
Corong gelas

V.Diagram Alir Percobaan :

PRAKT.BIOTEKNOLOGI 6
PRAKT.BIOTEKNOLOGI 7
PRAKT.BIOTEKNOLOGI 8
PRAKT.BIOTEKNOLOGI 9
PRAKT.BIOTEKNOLOGI 10
PRAKT.BIOTEKNOLOGI 11
 Pengambilan dan tahap analisis data

Data-data yang diambil meliputi aktivitas akstrak kasar protease sebelum dan sesudah
amobilisasi melalui pengukuran absorbansinya pada panjang gelombang maksimum.

VI. KESELAMATAN KERJA

Mengingat bahaya serta sifat bahan biologis yang digunakan, maka untuk keselamatan
kerja perlu diperhatikan hal hal tersebut dibawah ini :

1. Praktikan wajib mengenakan alat keselamatan kerja a.l; lab-jas, masker, penutup
kepala, sarung tangan. Hal ini dilakukan agar mikroba yang akan dibiakkan tidak
terhirup.
2. Memperlakukan kultur mikroba harus hati-hati. Teknik aseptik harus dilakukan
dengan benar sehingga tidak terjadi kontaminasi khususnya bila mikroba yang
digunakan bersifat pathogen.
3. Menggunakan alat pembakar spiritus harus hati-hati untuk menghindari terjadinya
kebakaran.
4. Sebelum praktikum dimulai praktikan sangat disarankan sarapan dan minum susu.

Vll. CARA PENGOLAHAN DATA

a. Pengaruh Temperatur Terhadap Aktivitas Protease Sebelum Amobilisasi dengan

Waktu Inkubasi 15 menit dan pH 8

Suhu Absorbansi Aktivitas

(maksnm) Protease
(oC) Sampel Kontrol (Unit)
(As) (Ak)

PRAKT.BIOTEKNOLOGI 12
b. Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Protease Sebelum Amobilisasi dengan Waktu
Inkubasi 15 menit dan Temperatur 300C

Absorbansi Aktivitas Protease

pH (maksnm)
Sampel (As) Kontrol (Ak) (Unit)

c. Pengaruh Pemurnian Protease Terhadap Aktivitasnya

Absorbansi Aktivitas
(maksnm) Protease
Sampel (As) Kontrol (Unit)
(Ak)
Sebelum
pemurnian
protease

Sesudah
pemurnian
protease

PRAKT.BIOTEKNOLOGI 13
d. Pengaruh Temperatur Terhadap Aktivitas Protease Amobil dengan Waktu Inkubasi
15 menit dan pH 8

Temperatu Absorbansi Aktivitas Protease

r (maksnm)
(oC) Sampel (As) Kontrol (Ak) (Unit)

e. Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Protease Amobil dengan Waktu Inkubasi 15 menit

dan Temperatur 370C
Absorbansi Aktivitas Protease
pH (maksnm)
Sampel (As) Kontrol (Unit)
(Ak)

PRAKT.BIOTEKNOLOGI 14
VIll. DAFTAR PUSTAKA

1. Siti Djenar , Nancy dan Iwhan Moehady, Bintang, 2006 , Isolasi dan amobilisasi
protease dari tempe, Prosiding Seminar Teknoin, UII
2. Bailey, J.E., and D.F. Ollis, 1986. Biochemical Engineering Fundamentals, Mc. Graw
Hill, Kogakusha, Ltd., Tokyo
3. Djenar, N.S,. 1992. Produksi amylase dari Chlamydomucor Sp. Untuk Proses
Sakarifikasi dalam Produksi Sirup Glukosa dari Pati Sagu, Tesis, ITB

PRAKT.BIOTEKNOLOGI 15