PENDAHULUAN
1. 1. Latar Belakang
Reaksi kimia yang terjadi dalam sistem biologis selalu melibatkan katalis. Katalis
ini dikenal sebagai katalis biologis (biokatalisator) berupa protein yang sangat spesifik
yang disebut enzim (Winarno, 1986), merupakan katalis yang sedang dikembangkan
dalam industri kimia. Pengembangan katalis biologis ditujukan untuk mengurangi
konsumsi energi proses serta menghilangkan terikutnya senyawa-senyawa pengotor
dalam produk suatu proses. Katalis ini digunakan sebagai alternatif katalis anorganik
seperti natrium, kalium atau kalsium hidroksida.
Enzim merupakan biokatalisator yang sangat efektif yang akan meningkatkan
kecepatan reaksi kimia spesifik secara nyata, dimana reaksi ini tanpa enzim akan
berlangsung lambat (Lehninger, 1995). Sifat-sifat istimewa enzim adalah kapasitas
katalitik dan spesifisitasnya yang sangat tinggi. Disamping itu enzim mempunyai peran
dalam transformasi berbagai jenis energi (Winarno, 1986).
(Kurnia, 2010)
1. 2. Tujuan Percobaan
1
Mengisolasi enzim dari sari daun pepaya dan sari bonggol nanas
1. 3. Manfaat Percobaan
1. Mahasiswa mampu mengisolasi enzim dari sari daun pepaya dan sari bonggol nanas
2. Mahasiswa mampu menghitung aktivitas enzim
3. Mahasiswa mampu membandingan aktivitas enzim berdasarkan variabel percobaan
4. Mahasiswa mampu menghitung parameter kinetika reaksi enzim
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
II.
II.
II.
3. Penggolongan Enzim
Berdasarkan biosintesisnya, enzim dibedakan menjadi enzim konstitutif dan
enzim induktif. Enzim konstitutif adalah enzim yang selalu tersedia di dalam sel
mikroba dalam jumlah yang relatif konstan, sedangkan enzim induktif adalah enzim
yang ada dalam jumlah sel yang tidak tetap, tergantung pada adanya induser. Enzim
induktif ini jumlahnya akan bertambah sampai beberapa ribu kali bahkan lebih
apabila dalam medium mengandung substrat yang menginduksi, terutama bila
substrat penginduksi merupakan satu-satunya sumber karbon (Lidya dan Djenar,
2000).
Berdasarkan tempat bekerjanya, enzim dapat dibedakan dalam 2 golongan, yaitu
endoenzim dan eksoenzim. Endoenzim disebut juga enzim intraseluler, dihasilkan di
dalam sel yaitu pada bagian membran sitoplasma dan melakukan metabolisme di
dalam sel. Eksoenzim (enzim ekstraseluler) merupakan enzim yang dihasilkan sel
kemudian dikeluarkan melalui dinding sel sehingga terdapat bebas dalam media yang
mengelilingi sel dan bereaksi memecah bahan organik tanpa tergantung pada sel yang
melepaskannya (Soedigdo, 1988).
(Kurnia, 2010)
II.
Pemecahan dinding sel dengan cara ini merupakan cara yang paling efektif.
Enzim litik yang umum digunakan adalah lisozim yang diperoleh dari putih telur.
Enzim ini memecah ikatan .-1,4 glikosida dari polisakarida (asam muramat)
penyusun dinding sel. Dinding sel bakteri gram positif lebih banyak mengandung
polisakarida dibandingkan dengan bakteri gram negatif, sehingga penggunaan
enzim litik lebih efektif untuk memecah dinding sel bakteri gram positif. EDTA
perlu ditambahkan pada media sebelum enzim ini digunakan untuk memecah
dinding sel bakteri gram negatif, untuk mengikat ion-ion divalen yang dapat
menginaktifkan enzim ini. Enzim lisozim sudah digunakan secara komersial pada
ekstraksi enzim glukosa isomerase dari Streptomyces sp. Jenis enzim lain : papain
mudah dikendalikan dan bersifat selektif
3. Alkali
Penempatan sel pada medium dengan pH 11 12,5 selama 20 menit menyebabkan
pecahnya dinding sel. Penggunaan cara ini hanya berhasil diterapkan untuk enzim
- enzim yang stabil pada pH tinggi.
b. Separation
Setelah dinding sel dipecahkan, maka enzim intra seluler yang diinginkan berada
dalam larutan yang mengandung enzim enzim lain, protein, asam nukleat,
metabolit, senyawa senyawa yang diperlukan untuk media dan lain lain. Bila
enzimnya ekstra seluler, maka enzim ini harus dipisahkan dari sel penghasilnya
dan senyawa senyawa lain yang terdapat dalam media. Untuk maksud tersebut,
dapat dilakukan pemisahan secara bertahap melalui beberapa cara, seperti :
klarifikasi dan presipitasi, sentrifugasi, filtrasi.
c. Presipitasi
Presipitasi adalah proses pemisahan partikel non enzim yang tercapur dengan
enzim dengan cara pengendapan. Partikel non enzim berasal dari penambahan
buffer, air, atau cairan fisiologis pada proses pemecahan dinding sel, atau molekul
molekul kompleks yang berikatan dengan enzim. Dapat dilakukan dengan
aman
untuk
II.
Batang, daun, dan buah pepaya muda mengandung getah berwarna putih. Getah ini mengandung
suatu enzim pemecah protein atau enzim proteolitik yang disebut papain ( Moehd, 1999 ). Papain
merupakan enzim proteolitik, yaitu enzim yang dapat mengurai dan memecah protein ( Warisno,
2003 ). Berdasarkan sifat-sifat kimianya, papain digolongkan sebagai protease sulfhidril
(Muchtadi et al., 1992). Papain memiliki 6 gugus sulfhidril, tetapi hanya dua gugus sulfhidril
yang aktif. Gugus suflhidril ini mengandung unsur sulfur sekitar 1,2%. Berdasarkan klasifikasi
the international union of biochemistry, papain termasuk enzim hidrolase yang mengkatalisis
reaksi hidrolisis suatu substrat dengan pertolongan molekul air. Aktivitas enzim papain cukup
spesifik karena papain hanya dapat mengkatalisis proses hidrolisis dengan baik pada kondisi pH
serta suhu dalam kisaran waktu tertentu. Manfaat dari getah pepaya (papain) ini adalah sebagai
pelunak daging sudah dikenal sejak dulu. Cara yang umum digunakan adalah dengan
membungkus daging tersebut beberapa saat dengan daun-daun pepaya yang telah dicacah.
Daging yang telah dibungkus dengan daun pepaya memiliki nilai gizi protein daging yang tinggi.
Selain itu, papain digunakan untuk industri minuman, tepatnya industri pembuatan bir. Bir yang
dibuat tanpa menggunakan papain menjadi tidak jernih dan berkabut bila disimpan dalam
keadaan dingin. Selain itu, beberapa industri lain juga memanfaatkan daya enzimatis papain ini
adalah industri keju, pengembangan kue, biskuit dan roti. Industri makanan ternak menggunakan
papain untuk menghasilkan konsentrat protein ikan. Industri farmasi menggunakan papain untuk
pengobatan penderita gangguan saluran pencernaan, penderita dispepsia, dan gastritis
Enzim
bromelin
merupakan
enzim
hidrolase yang aktif pada protein. Berdasarkan sifat-sifat kimia dari lokasi aktif, maka
enzim bromelin termasuk dalam golongan enzim protease sulfihidril, yang artinya
memiliki residu sulfidril (sistenil dan histidil) pada lokasi aktif. Susunan asam amino
yang mengandung gugus sistein pada sisi aktifnya sebagai berikut : -Cys Gly Ala
Cys Trp Asn Gly Asp Pro Cys Gly Ala Cys Cys Trp. 12 Konsentrasi
enzim bromelin pada bagian bonggol nanas lebih tinggi dibandingkan dengan daging
nanas. Aktifitas enzim bromelin dipengaruhi oleh kematangan buah, pH, suhu,
konsentrasi dan waktu.
protein melalui proses pengendapan garam. Pengendapan ini terjadi karena ion
ion garam amonium sulfat akan berkompetisi dengan protein untuk menarik
molekul air sehingga mengurangi molekul air pada bagian permukaan hidrofob
protein, dan menurunkan kelarutan protein, selanjutnya protein berinteraksi satu
sama lainnyamembentuk gumpalan dan mengendap. Molekul protein dengan berat
molekul besar memerlukan konsentrasi garam yang kecil untuk membentuk
endapan dan akanmengendap lebih dulu hal ini menyebabkan terjadinya efek
salting out (Fatoni, 2008). Salting out adalah peristiwa peningkatan muatan listrik
di sekitar protein, yang akan menarik mantel air dari koloid protein dan
menyebabkan peristiwa hidrofobikantarmolekul protein pada suasana ionik tinggi
yang menyebabkan penurunan kelarutan protein. Sedangkan pada konsentrasi
rendah, ion-ion ini akan mengelilingimolekul protein dan mencegah mereka
bersatu sehingga protein melarut. Peristiwa inidisebut salting in.Pengendapan
terjadi secara perlahan dan disetimbangkan selama 12 jam.Endapan yang terbentuk
dipisahkan dengan cara sentrifugasi, Untuk menghilangkansisa-sisa garam
amonium sulfat dan molekul-molekul kecil lainnya, maka endapanyang diperoleh
didialisis menggunakan tabung selovan (Elfi, 2003).
(Elfira, 2014)
II.
2. Konsentrasi substrat
Pada saat konsentrasi enzim konstan ber-tambahnya konsentrasi substrat
meningkatkan ke-cepatan reaksi enzimatis. Pada konsentrasi tertentu tidak
terjadi peningkatan kecepatan reaksi walau-pun konsentrasi substrat ditambah.
2. Suhu
Pada suhu rendah reaksi kimia berlangsung lam-bat, pada suhu tinggi secara
umum reaksi kimia berlangsung cepat. Pada suhu optimum kecepatan reaksi
enzimatis adalah maksimum. Pada suhu melewati suhu optimumnya dapat
menyebabkan terjadinya denaturasi enzim sehingga menurunkan kecepatan
reaksi.
3. Derajad Keasaman (pH)
Struktur enzim dipengaruhi oleh pH lingkungann-ya. Enzim dapat bermuatan
positif, negatif atau bermuatan ganda (zwitter ion). Pengaruh peru-bahan
pH lingkungan berpengaruh pada aktivitas sisi aktif dari enzim.
4. Inhibitor
Keberadaan inhibitor akan menurunkan kecepatan reaksi enzimatis. Inhibitor
dapat membentuk kom-pleks dengan enzim baik pada sisi aktiv enzim maupun
bagian lain dari sisi aktiv enzim. Ter-bentuknya komplek enzim inhibitor akan
menurunkan aktivitas enzim terhadap substratnya (Poedjiadi, 1994)
(Wuryanti, 2004)
II.
Gambar 2.1 Grafik hubungan konsentrasi substrat terhadap kecepatan reaksi enzimatis
Persamaan Michaeles Menten secara matematis dapat dinyatakan dalam persamaan :
Vmaks+[ S ]
Vo:
km+[S ]
dengan :
Vo
Vmaks
= kecepatan maksimum
Km
Protease merupakan kelompok enzim yang sangat kompleks yang menduduki posisi
sentral dalam aplikasinya pada bidang fisiologis dan produk-produk komersil. Protease
ekstraseluler berperan dalam hidrolisis substrat polipeptida besar. Enzim proteolitik intraseluler
memainkan peran penting dalam metabolisme dan proses regulasi pada sel hewan, tumbuhan,
dan mikroorganisme, seperti mengganti protein, memelihara keseimbangan antara degradasi, dan
sintesis protein. Protease intraseluler berperan dalam fungsi fisiologis lainnya, seperti
pencernaan, maturasi hormon, perakitan virus, respon imun, imflamantasi, fertilisasi, koagulasi
darah, fibrinolisis, kontrol tekanan darah, sporulasi, germinasi, dan patogenesis. Protease juga
diimplikasikan dalam peran regulasi ekspresi gen, perbaikan DNA, dan sintesis DNA (Rao et al.,
1998 dalam Rosliana, 2009).
Protease adalah enzim yang mengkatalisasi pemecahan ikatan peptida dalam peptida,
polipeptida, dan protein dengan menggunakan reaksi menjadi molekul-molekul yang lebih
sederhana seperti peptida rantai pendek, dan asam amino. Hidrolisis ikatan peptida adalah reaksi
penambahan-penghilangan, dimana protease bertindak sebagai nukleofili atau bereaksi dengan
membentuk satu molekul air. Secara umum nukleofili membentuk intermediat tetrahedral dengan
atom karbon karbonil pada ikatan peptida. Satu gugus amina dilepaskan dan dikeluarkan dari sisi
aktif, yang digunakan secara bersamaan dengan satu molekul air. Pada protease tertentu, adisi
enzim-asil dapat dibentuk. Intermediat tetrahedral kedua akhirnya dibentuk dan menghasilkan
produk karboksilat, proton, dan enzim bebas yang diregenerasi (Moran et al., 1994 dalam
Rosliana, 2009).
Kebanyakan protease stabil pada suhu normal (mesofilik), namun enzim mesofilik sering
tidak secara optimal beradaptasi dengan kondisi-kondisi dimana enzim diharapkan dapat
diterapkan. Beberapa strategi digunakan untuk meningkatkan karakteristik biokatalisator seperti
stabilitas, aktivitas, spesifitas, dan pH optimum. Isolasi enzim dari organisme yang mampu
bertahan di bawah kondisi-kondisi ekstrim, dapat menjadi sumber penting untuk biokatalis baru.
Akhir-akhir ini protease dari mikroorganisme termofilik menjadi pusat perhatian terutama
enzim-enzimnya. Mikroorganisme ini beradaptasi untuk tumbuh dalam cakupan luas pada suhu,
pH, dan tekanan selama evolusinya. Jenis yang ditemukan di atas suhu yang lebih tinggi (105113oC) hanya dari Archaea (Setter, 1996).
Protease bakteri termofilik menjadi pusat perhatian karena stabilitasnya pada suhu yang
lebih tinggi. Enzim termofilik secara optimal aktif lebih jauh di bawah kondisi terdenaturasi.
Hasil elusidasi struktur dari kristal enzim ini menunjukkan strukturnya lebih kaku dari enzim
mesofil karena struktur bagian dalam dari enzim termofilik mempunyai jaringan pasangan ion
yang sangat luas dibanding enzim mesofil (Yuwono, 2005). Sintesis protein pada suhu tinggi
tidak hanya membutuhkan enzim termostabil, tetapi juga membutuhkan asam inti yang
termostabil, yaitu mRNA, tRNA, dan rRNA. Perubahan kimia walaupun sedikit, tetapi akan
berakibat pada perubahan fisik dari tRNA yang sifatnya menjadi lebih stabil. Organisme termofil
mempunyai kecenderungan memiliki kandungan G+C yang tinggi. Semakin tinggi nilai G+C
maka semakin sukar molekul untai DNA dipisahkan. Adanya ion Mg 2+ yang melindungi
denaturasi akibat panas dan terjadinya tiolasi dari ribotimin menjadi 5-metil-2-tiouridin
menyebabkan enzim stabil pada suhu tinggi. Mekanisme dasar stabilitasnya adalah modifikasi
sekuen seperti penggantian konformasi glisin dengan residuresidu kaku, penambahan jembatan
garam, peningkatan interaksi hidrofobik, ikatan hidrogen dan pasangan ion tambahan,
meminimalkan akses luas permukaan hidrofobik, stabilitas heliks, dan perakitan subunit.
Formasi oligomer dan faktor lingkungan lain juga dapat menstabilkan enzim (Vieille dan Zeikus,
1998).
BAB III
METODOLOGI PERCOBAAN
III.
III.
III.
Etanol 25 ml
Cystein 0,5 gram
Celite 2 gram
NaCl 2 gram
Aquadest 15 ml
Induser enzim
a. Beaker Glass
h. Termometer
b. Centrifuge
i. Gelas Ukur
c. Cuvet
j. Pengaduk
d. Kertas Saring
k. Stopwatch
e. Magnetic Stirer
l. Timbangan
f. Tabung Reaksi
m. Indikator pH
g. Erlenmeyer Penghisap
n. Kompor Listrik
III.
2. Gambar Alat
Beaker glass
Cuvet
Centrifuge
Kertas Saring
Magnetic stirer
Tabung Reaksi
Erlenmeyer Penghisap
Termometer
Gelas Ukur
Pengaduk
Stopwatch
Timbangan
Indikator Ph
Kompor Listrik
III.
3. Cara Kerja
Isolasi Enzim
a
Haluskan bahan sumber enzim yang diperoleh dengan mortar, setelah halus ambil sari
daun pepaya 30 ml, masukkan dalam beaker glass.
Tambahkan ke dalam beaker glass tersebut celite 2 gram, cystein 0,5 gram, aquadest 15
ml, dan solvent secukupnya, lalu atur pHnya sampai 7
c Aduk dengan magnetic stirrer campuran tersebut selama 10 menit pada suhu ruangan
Saring dengan kertas saring dan menggunakan pompa vakum, sehingga didapat filtrat I
dan endapan I, buang endapannya.
Masukkan pada cuvet lalu disentrifugasi selama 20 menit dengan kecepatan 2000
rpm
g Saring hasil sentrifugasi dengan kertas saring dan menggunakan pompa vakum, sehingga
didapatkan endapan II dan filtrat II.
h Keringkan dan timbang endapan II (misal a gram), simpan endapan II
i
Tambahkan garam pengendap 2 gram pada filtrat II, lalu simpan 1 malam dalam lemari es.
j Saring filtrat II dengan kertas saring dan menggunakan pompa vakum, sehingga
didapatkan endapan III dan filtrat III.
Ambil endapan II, campurkan dengan endapan III, jika jumlah dari endapan II dan III (a +
b gram) lebih besar dari 1 gram, ambil 1 gram endapan tersebut, larutkan dalam air sampai
10 ml (larutan ini adalah enzim).
m Jika a+b kurang dari 1 gram, ambil 1 ml filtrat III, encerkan sampai 10 ml (larutan ini
adalah enzim).
Reaksi Enzimatis
Enzim Protease
a) Buat larutan susu 60 % V dengan basis 100 ml
b) Panaskan larutan casein tersebut sampai suhu 35 oC, 45 oC, 55 oC, 65 oC, 75 oC
c) Ambil 2 ml larutan enzim dan 3 ml larutan casein
d) Setelah mencapai suhu tersebut, tuangkan larutan enzim ke dalam larutan casein
A=
1
1
mCu
=
=(
)
E . t .V . t
gram
(Shuler dan Fikret , 1992
Dengan :
= densitas susu (kasein)
V = perbandingan volume enzim : susu
t = waktu penggumpalan