Makalah Pengantar Ensimologi

Purifikasi dan Strategi Enzim

Disusun oleh:
Ari Wardani (10/300464/PN/12043)
Ahsanatun Syahidawati (09/288778/PN/11863)

FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS GADJAH MADA
2012
 BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Enzim merupakan salah satu bagian yang penting dalam kehidupan manusia.
Perannya begitu penting dan tidak bisa diabaikan. Hal ini mengingat enzim sebagai
katalisator mampu untuk mempercepat reaksi. Aktivitas enzim sangat tergantung
pada kemurniannya. Kemurnian enzim ynag tinggi akan membuat aktiviatas enzim
semakin tinggi. Oleh karena itu perlu dilakukan pemurnian enzim. Pemurnian enzim
adalah suatu kegiatan memisahkan enzim yang diinginkan dari senyawa lain yang
tidak dikehendaki.
Pemurnian enzim dilakukan dengan strategi khusus yang terdiri terdiri dari
beberapa tahap yaitu ekstraksi, pemekatan dan fraksinasi.Tahap-tahap pemurnian
bergantung pada tujuan akhir pemurnian. Tujuan pemurnian ada 2 yaitu tujuan
komersial dan tujuan penelitian penelitian.

B. Tujuan
Tujuan penulisan makalah ini adalah untuk mengetahui pemurnian enzim dan strategi
pemurniannya.

C. Manfaat
Penulisan makalah ini diharapkan dapat memeberikan manfaat berupa:
a. Mengetahui cara-cara yang efektif untuk memurnikan enzim
b. Mengembangkan penelitian enzim yang bermanfaat untuk semua ranah
kehidupan.

BAB II
PEMBAHASAN

A. Pengertian Pemurnian
Suatu enzim tidak bisa dapat ditemukan langsung berbentuk enzim murni.
Mengingat enzim itu berada dalam tubuh makhluk hidup seperti di dalam sel
tumbuhan, hewan, dan manusia. Pada mulanya jika ingin mendapatkan suatu enzim
 untuk keperluan tertentu, maka perlu mengambil suatu sel dari bagian makhluk hidup.
Namun akhirnya cara tersebut dipandang tidak efektif sehingga dicari berbagai cara
untuk mendapatkan enzim murni.
Menurut Channel (1998) pemurnian berarti membebaskan suatu bahan dari
bahan-bahan lain yang tidak diinginkan atau sering disebut pengotor. Dijelaskan
bahwa tingkat kemurnian suatu produk enzim berbeda-beda tergantung pada metode
yang digunakan. Dengan mengetahui enzim yang didapatkan adalah enzim murni,
maka diharapkan dapat diperoleh data yang valid dalam penggunaannya.
Harris (1989) menyebutkan, minimal ada tiga strategi dalam pemurnian enzim
yang harus diperhatikan yaitu:
1. Kualitas
Perlu tindakan untuk mempertahankan aktivitas protein dengan cara
mengurangi proteolisis dan denaturasi.
2. Kuantitas
Pemakaian akhir dari protein murni akan menentukan kuantitas enzim
yang diperlukan
3. Ekonomis
Merupakan hal penting bila akandigunakan di industry atau dalam skala
laboratorium.
Secara umum permunian enzim bisa dibagi menjadi tiga bagian yaitu
ekstraksi, pemekatan, dan fraksinasi. Selain itu perlu diperhatikan pula sumber dari
enzim, metode homogenasi yang digunakan dan metode pemisahannya.
B. Ekstraksi Enzim
Enzim dapat didapatkan secara murni melalui ekstraksi. Bebrapa hal yang perlu
diperhatikan diantaranya mendeterminasikan enzim yang tidak diketahui dalam
bahan. Jika seorang akan mengekstraksi suatu enzim ada dua hal yang mesti
dipertanyakan karena menyangkut tentang pengaturan eksraksi. Yaitu:
1. Apa yang harus diisolasi?
2. Mengapa harus mencoba mengisolasi?
Minimal dengan dua pertanyaan ini, seseorang bisa merancang desain ekstraksinya.
Menyangkut pertanyaan pertama, berikut ini beberapa jawaban yang relevan antara
lain beberapa enzim yang tidak diketahui sangat penting dalam aktivitas metabolisme,
enzim tertentu hanya diproduksi secara spesifik oleh sel tubuh tertentu, dan semua
kejadian kimiawi dalam tubuh organism memiliki karakter tersendiri. Alasan- alasan
yang bisa menjawab diantaranya untuk memurnikan sejumlah enzim bisa dilakukan
sebagian atau keseluruhan, lebih khusus lagi untuk menyediakan bahan yang cukup
diizinkan untuk melakukan pengecekan struktur enzim, produkzi dengan jumlah
 enzim yang maksimal dapat digunakan untuk kepentingan yang akan datang dan tes
biologi yang lebih ekstensif.
C. Pemekatan Enzim
Pemekatan enzim dilakukan untuk memisahkan konsentrat protein dari
komponen biomolekul lainnya diantaranya karbohidrat, lemak dan asam nukleat. Ada
dua metode pemekatan enzim yaitu analitik dan preparatif (penyiapan). Metode
analitik menggunakan pengendapan asam (misalnya asam trikloroasetat),pengendapan
organik (misalnya aseton atau etanol), dan imunopresipitasi yang dapat menyebabkan
denaturasi protein. Metode preparatif bertujuan untuk tetap mempertahankan aktifitas
enzim, misalnya menggunakan garam, pelarut organik,polimer organik, ultrafiltrasi
dan liofilisasi (Bollag dan Edelstein, 1991).
D. Fraksinasi Enzim
Fraksinasi merupakan tahap akhir dalam pemurnian enzim, yang bertujuan
untuk memisahkan enzim dari protein non enzim lainnya. Metode fraksinasi umum
untuk pemurnian enzim, meliputi kromatografi kolom dan elektroforesis.
Elektroforesis adalah suatu teknik untuk memisahkan molekul-molekul
berdasarkan muatan dan berat molekul. Elektroforesis gel poliakrilamid (PAGE =
Poly Acrylamide Gel Electrophoresis) merupakan metode yang sering digunakan
dalam analisis sampelbiologis karena kemampuannya dalam memisahkan
campuran protein yangkompleks dengan baik dan resolusi yang tinggi (Bollag
dan Edelstein, 1991). Elektroforesis pada gel poliakrilamida adalah metode yang
paling sering digunakan untuk karakterisasi protein dan campuran protein, karena
prosedur inirelatif cepat dan sensitif. Elektroforesis didefnisikan sebagai
perpindahan partikel-partikel bermuatan karena pengaruh muatan medan listrik.
Mekanisme pada elektroforesis gel poliakrilamida sodium dodesil sulfat (SDS-
PAGE) adalah protein akan bereaksi dengan SDS yang merupakan deterjen
anionik membentuk kompleks berikatan dengan SDS. Kompleks protein yang
bermuatan negatif ini kemudian akan terpisahkan berdasarkan muatan dan
ukurannya secara elektroforesis di dalam matriks gel. Berat molekul protein
dapat diukur menggunakan protein standar yang telah diketahui berat molekulnya
dengan cara membandingkan nilai mobilitas relatifnya (Rf) (Bollag dan Edelstein
1991).
Zimografi adalah teknik elektroforesis untuk menetapkan aktifitas enzim
secara in situ. Berbeda dengan SDS-PAGE, gel pemisah zimografi mengandung
substrat enzim yang akan dihidrolisis oleh enzim selama masa inkubasi. Enzim
dipisahkan dalam gel denaturasi (SDS), namun dalam kondisi tidak tereduksi.
 Penambahan deterjen Triton X-100 akan melepaskan SDS sehingga protein
kembali melipat (renaturasi). Gel selanjutnya diwarnai sehingga molekul protein
yang memiliki aktifitas tampak sebagai pita bening. Metode zimografi bersifat
mudah, sensitif dan kualitatif dalam menganalisis aktifitas enzim. Adapun substrat
yang bisa digunakan untuk zimogram diantaranya kasein, gelatin dan lain-lain
(Leber dan Balkwill 1997).
Jenis- jenis fraksinasi enzim bergantung pada individual sampel dan tujuan
dari pemisahan. Biasanya sebuah kolom dijalankan eluate dibagi menjadi beberapa
bagian mengikuti kandungan senyawa. Misalkan eluate dari kolom silica memiliki
volume 10 ml diharapkan bisa dibagi menjadi 20 x 5 ml fraksinasi. Semakin kecil
jumlah yang difraksinasi diharapkan memiliki kandungan enzim yang lebih murni.
Hal ini juga mencegah terjadinya penghamburan target enzim. Sebagai alternative
digunakan berbagai metode untuk pemisahan meliputi HPLC ( high performance
liquid chromatography), dan dimonitori oleh sinar ultraviolet.
E. Strategi Purifikasi Enzim
Secara ringkas enzim memiliki startegi untuk pemurniannya. Di bawah ini merupakan
skema untuk memurnikan enzim:

a. Sumber
Sumber untuk medapatkan suatu enzim begitu melimpah di muka bumi ini. Misalkan
kelenjar laktasi mamalia merupakan sumber yang bagus untuk asetil KoA karboksilase dan
ginjal adalah sumber terbaik untuk mendapatkan enzim hidrolase semacam alkalin fosfat.
Selain itu pada E. Coli dapat digunakan untuk mensintesis beta galaktosidase. Memang tidak
semua bahan itu bisa disediakan dengan mudah mengingat kondisi gegografi dan ekonomi
suatu tempat. Namun hal ini bisa disiasati dengan mengeksplorasi dari hewan-hewan laut
khususnya untuk medapatkan jumlah yang besar. Sumber yang sudah ditentukan lalu
dilakukan homogenisasi sebagian atau pemecahan subseluler (organel sel). Hal ini akan
mendapatkan purifikasi organel. Jika sumber bahan dilakukan homogenisasi total maka akan
langsung mendapatkan ekstrak.
Setelah mendapatkan ekstrak suatu bahan maka langkah selanjutnya ialah untuk
mendapatkan hasil akhir berupa enzim murni. Hal ini bisa dilakukan melalui dua cara
tergantung tujuannya yaitu skala komersial atau skala penelitian. Skala komersial biasanya
menggunakan metode separasi atau pemisahan. Hasilnya akan mendapatkan enzim kasar.
Enzim kasar atau yang dimurnikan sebagian masih dapat digunakan untuk komersial. Metode
ini dipilih mengingat biaya yang dikeluarkan sangat besar padahal dalam skala komersial hal
yang harus diingat adalah minimalisasi biaya. Namun jika diinginkan enzim murni dalam
skala kecil perlu dilakukan perlakuan metode separasi yang kedua untuk mendapatkan jumlah
yang lebih murni.
Jika tujuannya skala penelitian maka menggunakan dengan metode afinitas separasi.
Metode ini akan menghasilkan enzim murni. Enzim murni atau hampir murni dikehendaki
dalam penelitian atau dipakai dalam produk analitik. Kemurnian ini sangat oenting karena
akan berpengaruh pada validitas data yang diperoleh.
b. Homogenisasi
Homogenisasi bertujuan untuk memecah sel dan mengekstrak isi yang dikandungnya.
Pilihan metode bergantung pada jenis jaringan atau organism yang digunakan sebagai sumber
enzim. Sebagai contoh jaringan mamalia pada kenyataannya lebih mudah untuk
dihomogenisasi daripada organisme lain. Jaringan diambil sebagian kecil lalu dihomogenisasi
dengan memutar pestle Teflon pada gelas mortar atau dengan blender berkecepatan tinggi.
Bagian sel yang penting untuk diambil berupa lisosom. Organel ini mengandung sejumlah
enzim hidrolase seperti protease. Adapun tekanan yang digunakan sebagai teknik
homogenisasi bergantung pada besar kesilnya sampel yang digunakan. Selama homogenisasi
bisa menghilangkan vakuola yang dapat menyebabkan kerusakan pada enzim. Sehingga perlu
ditambahkan buffer yang dapat mencegah kerusakan. Pada sumber enzim dari tumbuhan
mengandung sejumlah senyawa fenol yang memiliki pigment gelap. Hal ini dapat menganggu
sehingga pigmen dapat dihilangkan dengan diadsorpsi pada polimer polivinilpirolidon.
c. Metode Separasi
 Kesuksesan dari pemisahan enzim dapat ditentukan melalui ukuran, jumlah,
kelarutan, dan posisi bagian ikatan enzim. Berikut ini beberapa contoh metode yang
digunakan: jika mengacu pada ukuran atau massa maka yang digunakan ialah metode
centrifugasi, gel filtrasi, dan dialysis atau ultrafiltration dengan skala pada umumnya kecil.
Selanjutnya jika yang menjadi acuan kepolarannya maka dapat digunakan metode ion-
exchange chromatography, chromatofocusing, ekeltroforesis, isoelektric focusing, dan
hydrophobic chromatography dengan skala yang ditargetkan biasanya skala kecil. Lalu jika
yang menjadi pokok adalah kelarutannya maka metode yang dilakukan change in pH, change
in ionic strength, dan penurunan dielektrik konstan dengan skalanya biasanya besar. Terakhir
jika yang menjadi acuan adalah struktur enzimnya maka metode yang digunakan berupa
afnitas kromatografi, afnitas elution, dye-ligand chromatography, immunoadsorption, dan
covalent chromatography dengan target skala biasanya kecil.
 BAB III
PENUTUP
A. Kesimpulan
1. Pemurnian enzim beertujuan untuk mendapatkan enzim murni dari bahan-
bahan yang tersedia dalam jaringan makhluk hidup (hewan, tumbuhan,
manusia).
2. Sumber-sumber enzim di muka bumi melimpah, namun pemurnian bergantung
pada tujuan penggunaan enzim dan cara untuk memurnikan.
3. Pemurnian enzim dilakukan melalui tahap ekstraksi, pemekatan, dan
fraksinasi. Sedangkan starteginya dari sumber bahan enzim dihomogenisasi
untuk mendapatkan ekstrak lalu dilakukan meode afnitas untuk mendapatkan
enzim murni. Atau jika ingin mendapatkan jumlah besar (skala industry) dari
sumber bahan enzim dilakukan pemecahan subseluler sehingga didapatkan
organel murni lalu diekstrak dan dipreparasi ganda sehingga didapatkan enzim
murni.
B. Saran
Agar lebih baik maka berikut ini beberapa saran yang perlu diperhatika untuk
menghasilkan karya sejenis yang lebih baik di masa yang akan datang:
a. Perlu pengujian di laboratorium untuk membuktikan teori yang ada.
b. Perlu perluasan berbagai teori yang ada sehingga bisa saling melengkapi
informasi yang diperlukan.
c. Enzim yang akan dipurifikasi perlu dibuat semacam tabel, sehingga
memudahkan peta konsep pemurnian enzim.

DAFTAR PUSTAKA
Channel, Richard. JP. 1998. Natural Product Isolation. Humana press, New Jersey.
Harris. 1989.
Bollag, D. M. and S. J. Edelstein (1991). Protein Methods. New York, Chichester,
Brisbane, Toronto, Singapore, Wiley-Liss.
(Leber dan Balkwill 1997).