LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA II

ISOLASI PROTEIN

Disusun Oleh:

Nama: Noveryan Yusuf Malota

Nim: B1D120055

Kelas: 2020B

PRODI DIV TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIS

UNIVERSITAS MEGAREZKY

MAKASSAR

2021
 LEMBAR PENGESAHAN
PRAKTIKUM ISOLASI PROTEIN

Yang bertanda tangan dibawah ini, Dosen Pembimbing Praktikum Isolasi

Protein, menerima dan menyetujui Laporan Isolasi Protein yang disusun oleh:

Nama : Noveryan Yusuf Malota

Nim : B1D120055
Jurusan : DIV Teknologi Laboratorium Medis
Fakultas : Teknologi Kesehatan
Tanggal Praktikum : 13 Juli 2021

Laporan Praktikum Isolasi Protein ini dibuat menggunakan data yang

sebenar-benarnya

Makassar, 13 Agustus 2021

Dosen Pembimbing Praktikan

Nurfitri Arfani, S.Si., M.Si Noveryan Yusuf Malota

NIDN: 09 250393 01 Nim: B1D120055
 BAB I

PENDAHULUAN

1. Latar Belakang
Protein adalah kelompok biomolekul berukuran besar yang
terbentuk dari satu rantai panjang asam amino atau lebih. Protein memiliki
banyak fungsi dalam makhluk hidup, di antaranya mempercepat reaksi-
reaksi metabolisme, mereplikasi DNA, menanggapi rangsangan, memberi
bentuk sel dan tubuh, dan memindahkan molekul dari satu lokasi ke lokasi
lain.
Perbedaan utama antara satu protein dan protein lainnya adalah
urutan asam amino-asam aminonya, yang ditentukan oleh urutan
nukleotida dari gen-gennya, dan biasanya menyebabkan lipatan protein
menjadi struktur tiga dimensi khusus yang sesuai dengan fungsinya.
Susunan protein pada semua spesies mulai dari bakteri sampai manusia
dibentuk dari 20 asam amino yang sama dan tidak pernah berubah selama
evolusi.
Protein merupakan molekul yang sangat besar, sehingga mudah
sekali mengalami perubahan bentuk fisik maupun aktivitas biologis.
Banyak faktor yang menyebabkan perubahan sifat alamiah protein
misalnya : panas, asam, basa, pelarut organik, pH, garam, logam berat,
maupun sinar radiasi radioaktif. Perubahan sifat fisik yang mudah diamati
adalah terjadinya penjendalan (menjadi tidak larut) atau pemadatan. Ada
protein yang larut dalam air, ada pula yang tidak larut dalam air, tetapi
semua protein tidak larut dalam pelarut lemak seperti misalnya etil eter.
Daya larut protein akan berkurang jika ditambahkan garam, akibatnya
protein akan terpisah sebagai endapan. Apabila protein dipanaskan atau
ditambahkan alkohol, maka protein akan menggumpal. Hal ini disebabkan
alkohol menarik mantel air yang melingkupi molekul-molekul protein.
2. Rumusan Masalah
- Bagaimana teknik Isolasi Protein?
- Apa tujuan Isolasi Protein?
- Bagaimana cara kerja alat SDS – Page?

3. Tujuan Praktikum
Adapun tujuan praktikum kami kali ini yaitu:
- Untuk mengaplikasikan teknik isolasi protein
 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Isolasi Protein

Isolasi protein merupakan suatu cara yang digunakan untuk

memisahkan protein dari makromolekul lain yang tidak diinginkan.
Teknik isolasi protein ini harus mempertimbangkan sifat-sifat fisik dan
kimiawi dari protein tersebut agar tidak terjadi perubahan konformasi dan
aktifitasnya. Pada proses isolasi protein terdapat beberapa cara, salah
satunya adalah menggunakan teknik gel elektroforesis. Teknik ini
memiliki fungsi kerja yaitu memisahkan protein berdasarkan berat
molekulnya dalam suatu tegangan listrik tertentu. Teknik ini menggunakan
loading buffer yang berfungsi untuk mendenaturasi protein tersebut
sehingga protein yang semula tidak bermuatan menjadi bermuatan negatif.
Molekul sampel yang bermuatan negatif akan bergerak melalui dalam
matriks gel menuju ke elektroda positif.

Protein merupakan kelompok biomakromolekul yang sangat

heterogen. Ketika berada diluar makhluk hidup atau sel, protein sangat
tidak stabil. Untuk mempertahankan fungsi dan strukturnya, setiap jenis
protein membutuhkan kondisi tertentu setelah diekstraksi dari normal
biological milieu. Protein yang diekstraksi hendaknya dihindarkan dari
proteolisis atau dipertahankan aktivitas enzimatiknya. Untuk menganalisa
protein yang ada di dalam sel tersebut, diperlukan prosedur diantaranya (1)
memisahkan sel dari jaringannya, (2) menghancurkan membran sel untuk
mengambil kandungan sitoplasma dan organelnya serta (3) memisahkan
organel-organel dan molekul penyusunnya. Prosedur (1) dan (2)
dinamakan homogenasi dapat dilakukan dengan menggunakan alat yang
paling sederhana seperti homogeniser atau mortar sampai alat yang paling
muktahir seperti pemakaian alat vibrasi dan sonikasi tergantung pada
 bahan yang akan di homogenasi. Prosedur (3) dilakukan dengan
menggunakan penyaringan atau bahkan sentrifus dengan kecepatan dan
lama sentrifugasi tertentu.

Protein dari suatu bahan dapat dianalisa dengan isolasi protein.

Tujuan dari isolasi protein adalah untuk mendapatkan protein dengan
tingkat kemurnian yang tinggi sehingga kemudian dilakukan analisa lebih
lanjut. Isolat protein adalah produk turunan yang memiliki kandungan
protein hingga 90% dalam berat kering. Tahapan dalam isolasi protein
biasanya terdiri dari 2 tahap yaitu penghancuran sel dan pemisahan
partikel tertentu dari suspensi melalui sentrifugasi. Prinsip dari isolasi
protein adalah dengan mengkondisikan suatu bahan ke titik isoelektriknya
untuk mengendapkan molekul-molekul protein (Endres, 2001). Menurut
Ngili (2009), protein-protein tertentu dapat diendapkan dari campuran
bermacam protein. Pengendapan dapat dilakukan dengan penambahan zat
kimia tertentu, yaitu garam netral seperti ammonium sulfat (salting out),
pelarut organik seperti aseton dan ethanol atau zat pengendap atau asam
trikloroasetat. Sebelum dilakukan pengendapan, dilakukan proses
penghancuran sel (lisis sel) yaitu dengan menggunakan sonicator.
Kemudian, filtrat hasil sonicator disentrifugasi untuk menghilangkan
komponen lain yang mengganggu kemurnian dari protein.

B. Presipitasi Protein

a. TCA/Aseton

TCA/aseton merupakan salah satu metode yang digunakan

untuk presipitasi protein dengan menggunakan campuran dari 2-
mercaptoetanol (2ME) dan trichloroacetic acid (TCA) dalam
aseton dingin. Menurut Šamaj & Thelen (2007), penggunaan TCA
akan menginaktivasi enzim protease pada protein sehingga akan
menghambat aktivitas enzim selama proses isolasi. Kemudian
penggunaan aseton dalam metode ini juga akan memisahkan
 protein dari komponen-komponen yang mengganggu tingkat
kemurnian dari protein. Warna pellet protein yang terbentuk dalam
metode ini adalah putih atau cerah. Menurut wu et al (2014), warna
putih pada pellet mengindikasikan bahwa komponen phenolik dan
pigmen telah dihilangkan dari pellet.

b. Phenol-Chloroform

Phenol/chloroform merupakan salah satu metode yang

digunakan untuk ekstraksi asam nukleat yang murni dari
kontaminan protein. Metode ini didasarkan pada kemampuan dari
molekul organik untuk mendenaturasi dan mempresipitasi protein
dalam larutan dimana hal ini tidak berpengaruh pada kelarutan dari
asam nukleat (Graham & Rickwood, 1997). Dalam metode
phenol/chloroform akan terbentuk 3 macam lapisan yaitu upper
phase, interphase dan lower phase. Upper phase terdiri dari RNA,
sedangkan interphase dan lower phase terdiri dari DNA dan
protein. Untuk ekstraksi dengan phenol/chloroform ini diambil
upper phase yang terdiri dari RNA karena upper phase merupakan
bagian yang tidak mengandung protein, lipids, karbohidrat, dan
cell debris. DNA kemudian dipresipitasi dengan etanol atau
isopropanol (1:1). Sementara untuk penelitian ini, diambil
interphase dan lower phase yang terdiri dari protein untuk
dipresipitasi dengan menggunakan etanol (Tan & Beow, 2009).

c. Salting out

Salting out merupakan salah satu metode yang digunakan

untuk presipitasi protein dengan cara menambahkan garam ke
dalam protein hingga diperoleh larutan jenuh pada larutan protein.
Pada konsentrasi garam yang tinggi, kekuatan ion pada garam juga
akan semakin tinggi sehingga garam akan mengikat molekul air.
Dengan demikian terjadi gaya Tarik menarik antar garam dan air
sehingga protein akan terendapkan. Dalam metode salting out ini,
digunakan ammonium sulfat sebagai garam karena tingkat
kelarutannya sangat tinggi, tidak beracun dan murah (Alviyulita et
al, 2014). Sementara menurut Wingfield (2001), penggunaan
ammonium sulfat bertujuan untuk menstabilkan protein karena
ammonium sulfat akan menghentikan pertumbuhan bakteri dan
kontaminasi akibat dari aktivitas protease.
 BAB III

METODE PERCOBAAN

A. Alat dan Bahan

Adapun alat dan bahan yang digunakan pada praktikum ini yaitu

- Sentrifuse

- Blender atau Mortar

- Pipet

- Mikrotube

- Ikan Bandeng

- Udang

- Aquadest

B. Prosedur Kerja

Adapun prosedur kerja pada praktikum kali ini yaitu:

1. Pilihlah sampel yang akan diekstraksi yaitu ikan

2. Haluskan bahan yang telah disiapkan dengan mortar yang sudah

didinginkan dan diletakkan didalam bak es.

3. Tambahkan bufer ekstrak 1 mL ke dalam mortar kemudian ratakan.

4. Sentrifuge sampel dengan kecepatan 14.000 rpm selama 30 menit

5. Buanglah pelet dan ambil supernatan

6. Analisis sampel dengan SDS-Page.

 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil

Gambar hasil pengamatan isolasi protein (Supernatan)

B. Pembahasan

Pada praktikum kali ini kami menggunakan Ikan Bandeng sebagai

sampel praktikum Isolasi Protein. Ikan bandeng (Chanos chanos) adalah
ikan pangan populer di Asia Tenggara. Ikan ini merupakan satu-satunya
spesies yang masih ada dalam suku Chanidae (bersama enam genus
tambahan yang dilaporkan pernah ada namun sudah punah). Dalam bahasa
Bugis dan Makassar dikenal sebagai ikan bolu, dan dalam bahasa Inggris
milkfish).
 Mereka hidup di Samudera Hindia dan Samudera Pasifik dan
cenderung berkawanan di sekitar pesisir dan pulau-pulau dengan terumbu
koral. Ikan yang muda dan baru menetas hidup di laut selama 2–3 minggu,
lalu berpindah ke rawa-rawa bakau berair payau, dan kadang kala danau-
danau berair asin. Bandeng baru kembali ke laut kalau sudah dewasa dan
bisa berkembang biak.

Komposisi gizi per 100 gram daging ikan bandeng adalah energi
129 kkal, protein 20 gr, lemak 4,8 gr, kalsium 20 mg, fosfor 150 mg, besi
2 mg, vitamin A150 SI dan vitamin B1 0.05 mg. Protein bandeng cukup
tinggi, sehingga kondisi ini menjadikan ikan bandeng sangat mudah
dicerna dan baik di konsumsi oleh semua usia untuk mencukupi kebutuhan
protein tubuh, menjaga dan memelihara kesehatan serta mencegah
penyakit akibat kekurangan zat gizi.

Dalam prosedur kerjanya kami menggunakan Sentrifuse untuk

memisahkan antara protein dengan kandungan zat lain. Sentrifuge adalah
alat yang paling sering ditemukan karena fungsinya yang penting.
Centrifuge digunakan untuk memisahkan partikel organel yang larut
sehingga membentuk endapan yang terpisah berdasarkan perbedaan massa
jenis dari partikel pembentuk larutan tersebut.

Prinsip kerja sentrifuge adalah dengan memisahkan partikel yang

terkandung di dalam suatu larutan menurut ukuran, bentuk, kerapatan
molekul, viskositas dari medium tersebut serta kecepatan rotor. Sentrifuge
memanfaatkan gaya sentrifugal, yakni gaya putar yang menjauhi pusat
lingkaran sehingga pada suatu cairan, partikel yang lebih besar akan secara
otomatis menjauh, sedangkan partikel yang lebih kecil akan berkumpul
dan membentuk endapan di bagian tengah cairan. Semakin besar
perbedaan kerapatan antara partikel larutan, maka akan semakin cepat
pergerakannya. Sedangkan, partikel dengan kerapatan yang lebih besar
akan terkumpul di dasar membentuk sedimentasi, terpisah dari partikel
dengan kerapatan yang lebih rendah yang akan mengapung di atasnya.

Prinsip isolasi protein dilakukan dengan tahap-tahap sebagai

berikut, pertama-tama protein diekstrak dari bahan dengan air pada pH
basa (sekitar pH 8-8.5). Protein sebagian besar akan larut dalam air
pengekstrak pada pH ini. Kemudian ekstrak disentrifuse untuk
mengendapkan bahanbahan yang tidak larut berupa ampas dan kotoran
lainnya. Supernatan yang mengandung protein yang larut dipisahkan dan
diturunkan pHnya sampai sekitar pH 4-4.5. Protein pada pH ini sebagian
besar akan mengendap pada titik isoelektriknya. Proses sentrifuse akan
memisahkan protein berupa endapan dan cairan sisa yang mengandung
bahanbahan terlarut seperti gula, mineral dan sebagainya. Endapan protein
kemudian dicuci dengan air berkali-kali untuk selanjutnya dilarutkan
kembali dalam suasana basa dengan natrium hidroksida. Larutan protein
kemudian dikeringkan dengan alat pengering semprot (spray dryer).

Protein sendiri dapat terjadi denaturasi. Denaturasi protein

merupakan suatu proses dimana terjadi perubahan atau modifikasi
terhadap konformasi protein, lebih tepatnya terjadi pada struktur tersier
maupun kuartener dari protein. Pada struktur tersier protein misalnya,
terdapat empat jenis interaksi pada rantai samping seperti ikatan hidrogen,
jembatan garam, ikatan disulfida, interaksi non polar pada bagian non
hidrofobik. Adapun penyebab dari denaturasi protein bisa berbagai
macam, antara lain panas, alkohol, asam-basa, maupun logam berat.

Penambahan buffer ekstrak bertujuan untuk memecahkan sel-sel

yang terdapat dalam bahan. Penambahan ammonium sulfat ini berfungsi
untuk mengendapkan protein hingga jenuh dimana endapannya akan
disaring sehingga terbentuk dua bagian yaitu filtrate dan residu (endapan).
Menggunakan aquades dengan tujuan untuk mengetahui endapan dapat
larut dalam air. Pada saat uji kelarutan dalam air, endapan tidak larut
dalam air hal ini dapat di katakan bahwa protein yang di gunakan sudah
mengalami denaturasi yaitu perubahan sifat fisik. Hal ini di sebabkan
rusaknya ikatan hydrogen dan ikatan non polar pada struktur berlipat dari
protein.
 BAB V

PENUTUP

A. Kesimpulan

Pada praktikum kali ini didapatkan hasil supernatan yang

dimasukkan kedalam mikrotube. Supernatan ini terdapat 2 lapisan yang
lapisan atas dinamakan α-Lactalbumin dan lapisan bawah dinamakan β-
Lactoglobulin

B. Saran

Dalam mengisolasi protein terdapat banyak faktor faktor yang

dapat mempengaruhi hasil isolasi, oleh karena itu Ketelitian sangat
diperlukan dalam praktikum kali ini agar tidak terjadi kegagalan pada hasil
tersebut
 Daftar Pustaka

Lowry, N.: Rosenbroug, A. 1951. Farr: Randal, R. “Protein Measurement with

the folin phenol reagent”. J. Biol. Chem., 193, 265-275.

Iskandar Muthe. (2016). “Analisis Kadar Protein Ikan Depik (rasbora

tawarensis) di Danau Laut Tawar Kabupaten Aceh Tengah”, vol 10.

Diana, F. M. (2009). “Fungsi dan Metabolisme Protein dalam Tubuh Manusia.

Jurnal Kesehatan Masyarakat” Vol. 4. No. 1.

Saputra, F, R. 2014. Aplikasi Metode SDSPAGE (Sodium Dodecyl Sulphate

Polyacrilamid Gel Elektroforesis) untuk Mengidentifikasi Sumber
Gelatin pada Kapsul Keras”. Skripsi. UIN Syarif Hidayatullah:
Jakarta