TEKNIK ANALISIS BIOMOLEKULER

“Purification”

Disusun guna melengkapi Tugas UAS Mata Kuliah Teknik Analisis Biomulekuler
Program Pasca Sarjana (S-2) Ilmu Kesehatan Masyarakat

Disusun Oleh :

Khrisna Agung Cendekiawan, S.Farm., Apt (172520102043)

PASCA SARJANA UNIVERSITAS JEMBER

MAGISTER ILMU KESEHATAN MASYARAKAT

2018
 Pemurnian protein adalah serangkaian proses yang yang dimaksudkan untuk mengisolasi
satu jenis protein dari campuran kompleks. Pemurnian protein sangat penting untuk
karakterisasi struktur, fungsi dan interaksi dari suatu protein. Bahan awal biasanya adalah
jaringan biologis atau budaya mikroba. Berbagai langkah dalam proses pemurnian dapat
bebas protein dari matriks yang batas-batas itu, memisahkan protein dan bagian non-protein
campuran, dan akhirnya memisahkan protein yang diinginkan dari semua protein lainnya.
Langkah Pemisahan dapat mengeksploitasi perbedaan (misalnya) protein ukuran, sifat fisika-
kimia, afinitas mengikat dan aktivitas biologis.
Metode yang digunakan dalam pemurnian protein secara umum dapat dibagi menjadi 2
yaitu metode analisis dan preparatif. Metode analisis bertujuan untuk mendeteksi dan
mengidentifikasi protein dalam campuran, sedangkan metode preparatif bertujuan untuk
menghasilkan jumlah besar protein untuk keperluan lain, seperti biologi struktural atau
penggunaan industri.
Langkah pertama dalam pemurnian protein tertentu kebanyakan dilakukan dengan teknik
pengendapan. Teknik ini terutama ditujukan untuk memisahkan protein dari senyawaan
bukan protein yang terlarut. Protein dapat diendapkan dengan penambahan garam (salting
out), pengaturan pH, pengaturan suhu dan penambahan pelarut organic seperti alcohol atau
aseton. Namun beberapa jenis protein tidak dapat diendapkan dengan garam, bahkan
penambahan garam akan mempertinggi kelarutannya (salting in). sifat protein seperti ini
dapat juga digunakan untuk pemurnian protein tersebut. Sentrifugasi banyak digunakan untuk
mempercepat pengendapan protein.
Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul
dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di
dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi
tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan
yang bervariasi, contohnya 2500 rpm (rotation per minute) atau 3000 rpm.
Metode kromatografi dapat diterapkan dengan menggunakan peralatan HPLC kolom atau
otomatis. Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase-balik, pertukaran ion atau
ukuran-pengecualian metode, dan sampel terdeteksi oleh array dioda atau teknologi laser.
 Kromatografi fase-balik memisahkan protein berdasarkan sifat hidrofobik suatu
senyawa. Teknik ini sangat selektif tetapi membutuhkan penggunaan pelarut organik.
Beberapa protein didenaturasi dengan pelarut secara permanen akan kehilangan
fungsi selama kromatografi. Maka dari itu metode ini tidak direkomendasikan untuk
semua aplikasi, terutama jika diperlukan sampel suatu protein target untuk
mempertahankan aktivitas.
 Kromatografi Pertukaran ion mengacu pada pemisahan protein berdasarkan
elektron pada senyawa. Kolom biasanya disiapkan untuk pertukaran anion atau kation
dimana kolom berisi fase diam dengan muatan positif yang menarik protein
bermuatan negatif atau sebaliknya. Kolom yang bermuatan negatif akan menarik
protein bermuatan positif. Elusi dari protein target (s) dilakukan dengan mengubah pH
dalam kolom, sehingga dapat menghasilkan perubahan pada protein target.

 Filtrasi gel Kromatografi memisahkan antara protein yang ukurannya lebih besar
dengan ukuran yang kecil dalam kolom kromatografi. Protein besar tidak masuk ke
pori-pori polimer sedangkan protein yang lebih kecil akan lebih lama berada dalam
kolom kromatografi. Selanjutnya Eluat atau hasil eluasi tersebut dikumpulkan dalam
serangkaian tabung yang digunakan untuk memisahkan protein berdasarkan waktu
elusi. Filtrasi gel adalah alat yang berguna untuk sampel protein yang memiliki
konsentrasi, karena pada metode ini dapat dilakukan pemisaghan secara spesifik
antara protein dengan ukuran besar dengan ukuran lebih kecil, sehingga pemisahan
akan spesifik sesuai dengan tujuan penelitian dan protein target yang diperoleh akan
sesuai.

 Kromatografi Afinitas adalah teknik yang sangat berguna untuk menyelesaikan

proses pemurnian protein. Senyawa dalam kolom kromatografi adalah cross-linked
untuk ligan yang mengikat khusus untuk protein target. Protein ini kemudian dihapus
dari kolom dengan bercampur dengan larutan yang mengandung ligan bebas. Metode
ini umumnya memberikan hasil paling murni dan memiliki aktivitas spesifik tertinggi
dibandingkan dengan teknik lain.