Study in Vitro digunakan untuk mempelajari interaksi antara protein dan obat yang berdasarkan

prinsip pemisahan antara obat yang terikat dengan obat bebas, dengan begitu maka dapat
ditentukan konsentrasi obat yang bebas atau yang terikat dan deteksi perubahan sifat
fisikokimia dari protein yang terjadi akibat interaksi dan obat. Umumnya interaksi antara
protein dengan obat dapat dipelajari secara in Vitro. Berdasarkan prinsip pemisahan, contoh
metode analisis yang umum digunakan adalah ultrafiltrasi, ultrasentrifugasi,  equilibrium
dialysis, elektroforesis dan kromatografi. Sedangkan berdasarkan deteksi perubahan sifat
fisikokimia protein, contoh metode analisis yang umum digunakan dalam studi protein binding
adalah spektroskopi.

2.1 Dialisis

Pada umumnya metode penentuan ikatan antara obat yang protein yang dilakukan dengan
pemisahan berdasarkan bobot molekul dengan menggunakan membran semipermeabel
disebut dengan dialisis. Molekul yang jauh lebih besar dibandingkan obat adalah protein yang
menyebabkan obat yang terikat dengan protein dapat dipisahkan dengan obat bebas
berdasarkan perbedaan ukurannya. Ekuilibrium dialisis merupakan aplikasi dialisis yang
digunakan dalam studi ikatan antara obat dan protein, yang memiliki prinsip untuk memisahkan
dua larutan berbeda dengan menggunakan membran semipermeabel. Sehingga Seiring
berjalannya waktu, molekul tersebut akan berpindah ke kompartemen lain, sehingga dapat
mencapai kesetimbangan diantara dua kompartemen yang dipisahkan oleh membran.
Sedangkan Dynamic dialisis adalah salah satu metode dialisis yang digunakan untuk studi ikatan
obat protein. Sebenarnya dynamic dialisis memiliki prinsip yang sama dengan ekuilibrium
dialisis, tetapi pada dynamic dialisis terdapat turbulensi pada sistem sehingga molekul dapat
berdifusi lebih cepat dibandingkan dengan ekuilibrium dialisis. Ekuilibrium dialisis banyak
digunakan sebagai metode untuk mempelajari interaksi protein obat karena merupakan
metode yang sederhana dan mudah, serta dapat digunakan pada banyak jenis protein dan obat
pada studi in Vitro maupun in Vivo. Metode ini terbatas untuk obat-obatan yang memiliki
kelarutan rendah di air. Metode ini juga memiliki kekurangan yaitu waktu untuk mencapai
kesetimbangan antara dua kompartemen umumnya sangat lama dan sebelum studi
dilaksanakan juga harus ditentukan terlebih dahulu waktu sistem untuk mencapai
kesetimbangan. Keberadaan protein pada suatu kompartemen yang dipisahkan dapat
mengakibatkan terjadinya tekanan onkotik atau osmotik, sehingga menyebabkan molekul air
bergerak dari lingkungan hipotonik ke hipertonik. Kekurangan pada metode ini juga dapat
berupa terjadinya adsorpsi protein maupun molekul pada dinding membran dan kemudian
terjadinya efek donnan, yang merupakan efek yang terjadi pada partikel bermuatan di mana
partikel itu akan terabsorbsi di permukaan membran sehingga sulit berdifusi untuk melewati
membran

2.2 Filtrasi

Prinsip filtrasi adalah melakukan pemisahan atau penyaringan pada larutan dengan
menggunakan membran semipermeabel yang sama dengan dialisis. Ketika molekul kecil
berdifusi maka akan melewati membran, dan molekul yang lebih besar akan bertahan.
Ultrafiltrasi merupakan metode yang sering digunakan dalam studi ikatan protein obat, yaitu
metode filtrasi yang menggunakan tekanan guna mendorong larutan melewati membran
sehingga proses filtrasi dapat berjalan lebih cepat. Ultrafiltrasi seringkali digunakan untuk
mempelajari ikatan protein obat karena merupakan metode yang murah sederhana dan simple,
seperti halnya dengan equilibrium dialisis. Ultrafiltrasi memiliki kekurangan yaitu dapat
terjadinya adsorpsi dari molekul pada permukaan membran, serta terjadinya efek Donnan dan
kebocoran sehingga proses pemisahan tidak dapat dilakukan dengan baik. Diafiltrasi juga
seringkali digunakan dalam metode filtrasi, yang memiliki prinsip sama dengan ultrafiltrasi,
namun selama proses difiltrasi pelarut atau air ditambahkan ke dalam larutan agar menghindari
terjadinya pemekatan pada larutan yang difiltrasi.

2.3 Ultrasentrifugasi

Selain ekuilibrium dialisis dan ultrafiltrasi, ultrasentrifugasi juga dapat digunakan sebagai
alternatif metode. Hal ini dikarenakan ultrasentrifugasi dapat mencegah terjadinya masalah
yang terjadi pada penggunaan membran semipermeabel pada saat pemisahan molekul obat
dan protein. Ultrasentrifugasi memiliki prinsip, yaitu memisahkan protein dan obat terikat
protein dengan obat bebas yang dilakukan dengan gaya sentrifuga. Larutan tersebut akan
diputar dengan kecepatan tertentu agar protein dapat mengendap dan obat bebas akan berada
pada supernatan. Kekurangan dari metode ini adalah lebih mahal dibandingkan dengan
ultrafiltrasi maupun equilibrium dialisis, viskositas dan sementasi juga dapat mempengaruhi
metode ini. Hasil penelitian yang menggunakan metode ini menuai hasil yang berbeda dengan
equilibrium dialisis, Karena konsentrasi obat bebas yang didapat pada ultrasentrifugasi lebih
tinggi dibandingkan dengan equilibrium dialysis.

2.4 Kromatografi

Metode pemisahan yang banyak digunakan dalam analisis disebut dengan kromatografi. Data
yang didapatkan dari kromatografi ini dinilai lebih reprodusibel dan presisi dibandingkan dari
equilibrium dialysis, ultrafiltrasi, maupun ultrasentrifugasi. Kromatografi gel eksklusi sering
digunakan dalam studi ikatan antar protein obat, karena pada metode ini protein dan obat yang
berikatan dengan protein akan dipisahkan dengan molekul obat bebas sesuai dengan
perbedaan ukuran molekul. Molekul yang berukuran lebih kecil akan terjerap dalam pori gel,
sedangkan yang berukuran besar akan terlebih dahulu terelusi. Kromatografi eksklusi memiliki
efisiensi dan recovery jumlah protein yang rendah, sehingga seringkali dinilai tidak efektif
digunakan dalam studi protein binding. Dari sinilah dikembangkan metode kromatografi lainnya
yang lebih efisien, yaitu kromatografi afinitas. Metode kromatografi yang menggunakan ligan
tertentu yang menempel pada suatu polimer stasioner disebut dengan kromatografi afinitas.
Kromatografi afinitas menggunakan protein sebagai ligan, dengan demikian maka kondisi
larutan uji menjadi mirip kondisi fisiologis seringkali mengganggu analisis karena dapat
mengakibatkan perubahan konformasi dari protein.

2.5 Elektoforesis Kapiler

Metode pemisahan dimana molekul yang bermuatan akan bergerak menuju katoda dengan
muatan berlawanan disebut elektroforesis. Metode ini banyak dipakai untuk studi protein
banding yaitu elektroforesis kapiler. CE memiliki efisiensi dan selektivitas yang tinggi dalam
pemisahan, serta proses analisis dapat dilakukan pada pH yang mendekati pH fisiologis tanpa
mengganggu pengukuran. Tetapi biasanya masalah yang seringkali timbul adalah terjadinya
peristiwa adsorpsi molekul protein pada permukaan kapiler karena luasnya permukaan kontak
kapiler.
2.6 Spektroskopi

Metode yang tidak menggunakan pemisahan dalam proses analisis nya disebut spektroskopi.
Hal ini dikarenakan metode ini digunakan untuk melihat struktur tiga dimensi dari protein dan
struktur komplementernya. Selain itu, metode ini juga dapat digunakan untuk melihat variasi
konformasi dari molekul protein berdasarkan ikatan ligannya. Dengan demikian maka metode
ini hanya dapat mendeteksi ikatan yang kuat dan tidak dapat mendeteksi obat yang berikatan
lemah. Metode ini biasanya digunakan dalam studi protein binding yaitu spektroskopi
fluoresensi. Dengan spektroskopi fluoresensi, maka suatu senyawa digunakan untuk marker
pada protein dan obat agar jumlah obat yang terikat pada protein dapat diukur berdasarkan
konsentrasi yang terpancar dari ikatan obat-protein. Spektroskopi fluoresensi juga dapat
digunakan untuk identifikasi binding side dan pengukuran jarak ikatan yang dihitung
berdasarkan jarak fluorofor yang terikat pada kedua molekul

2.7 Optical Rotatory Dispersion (ORD) atau Circular Dichroism (CD)

Metode ini digunakan untuk mempelajari perubahan konformasi dari struktur protein yang
merupakan suati akibat dari terbentuknya ikatan dengan obat. Metode ini biasanya digunakan
untuk mempelajari konformasi serta kiralitas dari protein, sebab protein merupakan
makromolekul yang mempunyai sifat kiral.

2.8 Metode Lainnya

Sebenarnya masih banyak metode yang dapat digunakan untuk studi protein binding yaitu
kalorimetri, polarografi, FPIA, dan lain-lain. Metode analisis studi protein binding memiliki hal
yang penting, yaitu metodenya dapat secara akurat spesifik dan efisien digunakan untuk
menganalisis ikatan antara protein dan obat, baik secara kuantitatif ataupun secara kualitatif.
Preparasi sampel tentu saja harus dilakukan dengan baik agar tidak mempengaruhi perubahan
struktur protein, karena protein memiliki struktur yang dapat berubah konformasi. Jika
preparasi sampel tidak dilakukan dengan baik, maka akan mengakibatkan hasil pengukuran
menjadi tidak akurat.