Pemisahan Protein

Pada laboratorium yang lengkap, pemisahan protein dapat dilakukan dengan beberapa teknik, yaitu :
1. Salting out. Tiap-tiap protein berbeda sifat pengendapannya.

2. Ultra sentrifugasi. Protein dengan BM yang besar akan mengendap paling cepat.
3. Elektroforesis. Perbedaan kecepatan migrasi pada medan listrik berdasarkan IEP.

4. Kromatografi. Perbedaan kecepatan gerak pada media berdasarkan ukuran molekul.

5. Teknik immunokimia. Antibodi tertentu akan terikat dengan antigen yang sesuai.

Pembuatan filtrate bebas protein menurut :

1. Folin Wu
Masukkan 1 mL serum kdalam tabung sentrifuge. Tambahkan 7 mL aquadest, kemudian campur larutan. Tambahkan 1 mL Na. Tungstat 10%, campur lalu tambahkan 1 mL H2SO4 2/3 N.
Campur sampai rata selama 3 menit dan diamkan selama 5 menit. Setelah itu sentrifuge selama 5 menit dan ambil filtratnya, atau dapat pula disaring dengan kertas saring. Mengambil filtrate
harus hati-hati, jangan sampai endapan ikut masuk ke pipet. Cara yang lebih aman untuk mengambil filtrate adalah dengan disaring.
2. Somogy
Masukkan 1 mL darah/serum/plasma ke dalam tabung sentrifuge. Tambahkan 7 mL aquadest, campur dengan baik agar darah haemolisis (jika yang digunakan adalah darah). Tambahkan 1
mL ZnSO4 10%, campur dengan baik dan tambahkan 1 mL NaOH 0,5N. Setelah itu, sentrifuge selama 5 menit dan ambil filtratnya. Ambil filtratnya dengan hati-hati jangan sampai keruh, atau
dapat pula disaring dengan kertas saring.
Pustaka :
Dr. Zulbadar Panil, 2008, Memahami Teori dan Praktik Biokimia Dasar Medis. ( EGC-Jakarta)

Metode kromatografi dapat diterapkan dengan menggunakan bangku-top peralatan HPLC kolom atau otomatis. Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase-balik, pertukaran ion
atau ukuran-pengecualian metode, dan sampel terdeteksi oleh array dioda atau teknologi laser.

Kromatografi fase-balik (RPC) memisahkan protein

berdasarkan hydrophobicitiesrelatif mereka. Teknik ini sangat selektif tetapi
membutuhkan penggunaan pelarut organik. Beberapa protein didenaturasi dengan
pelarut secara permanen dan akan kehilangan fungsi selama RPC, karena metode
ini tidak direkomendasikan untuk semua aplikasi, terutama jika diperlukan untuk
protein target untuk mempertahankan aktivitas.
Pertukaran ion kromatografi mengacu pada pemisahan protein
berdasarkan biaya.Kolom baik dapat disiapkan untuk pertukaran anion atau
kation anion exchangerates kolom berisi fase diam dengan muatan positif yang
menarik protein bermuatan negatif kation kolom pertukaran sebaliknya.,. Manik-
manik bermuatan negatif yang menarik protein bermuatan positif. Elusi dari protein
target (s) dilakukan dengan mengubah pH dalam kolom, yang menghasilkan
perubahan atau netralisasi kelompok fungsional protein bermuatan masing-masing.

Ukuran-pengecualian kromatograf (filtrasi gel) memisahkan protein yang

lebih besar dari yang kecil, karena molekul yang lebih besar perjalanan lebih cepat
melalui polimer cross-linked dalam kolom kromatograf. Protein besar tidak masuk
ke pori-pori polimer sedangkan protein yang lebih kecil, dan lebih lama untuk
melakukan perjalanan melalui kolom kromatograf, melalui rute kurang langsung
mereka. Eluat dikumpulkan dalam serangkaian tabung memisahkan protein
berdasarkan waktu elusi. Filtrasi gel adalah alat yang berguna untuk berkonsentrasi
sampel protein, karena protein target adalah mengumpulkan dalam volume elusi
lebih kecil dari pada awalnya ditambahkan ke kolom. Teknik fltrasi yang sama dapat
digunakan selama protein skala produksi besar karena efektivitas biaya mereka.

Afinitas kromatografi adalah teknik yang sangat berguna untuk "memoles"

atau menyelesaikan proses pemurnian protein. Manik-manik dalam kolom
kromatograf adalah cross-linked untuk ligan yang mengikat khusus untuk protein
target. Protein ini kemudian dihapus dari kolom dengan berkumur dengan larutan
yang mengandung ligan bebas. Metode ini umumnya memberikan hasil paling
murni dan tertinggi aktivitas spesifk dibandingkan dengan teknik lain.
Visualisasi Protein dan Penilaian Pemurnian
SDS-PAGE elektroforesis gel poliakrilamida adalah, dilakukan di hadapan SDS (natrium dodesil sulfat) yang mengikat ke protein memberikan mereka muatan negatif yang besar
bersih. Karena biaya dari semua protein yang cukup sama, metode ini memisahkan mereka hampir seluruhnya didasarkan pada ukuran. SDS-PAGE sering digunakan untuk menguji kemurnian
protein setelah setiap langkah dalam seri. Sebagai protein yang tidak diinginkan secara bertahap dihapus dari campuran, jumlah band divisualisasikan pada gel SDS-PAGE, berkurang, sampai
hanya ada satu band yang mewakili protein yang diinginkan.