ELEKTROFORESIS

DIAN RIANA NINGSIH, M.Si

Elektroforesis
adalah pergerakan suatu molekul yang bermuatan dalam medan listrik melalui suatu pelarut. Kecepatan migrasi (V) protein, atau makromolekul lain seperti DNA dan RNA dalam medan listrik tergantung pada kekuatan medan listrik (E), muatan protein (z) dan koefisien gesekan (f) V = Ez... .(1) f Koefisien gesekan spesifik untuk setiap molekul, maka gerakan molekul dalam medan listrik dinyatakan dalam mobilitas molekul ().

 didefinisikan sebagai kecepatan per satuan medan listrik = V (2) E 1 sub 2 = Ez = z Ef f memberi informasi mengenai ukuran dan bentuk molekul

Penggunaan Elektroforesis
1. Untuk pemisahan atau pemurnian protein Pemisahan berdasarkan muatan listrik dan dibawah pengaruh medan listrik, 2. Penentuan jumlah dan bobot molekul sub unit protein SDS gel elektroforesis

Pembagian Elektroforesis Berdasarkan Media Pendukung

Elektroforesis batas bebas menggunakan media larutan berair Elektroforesis berbatas (zone)

berupa padatan seperti kertas selulosa, gel pati dan gel poliakrilamida Gel bertindak sebagai saringan molekul yang meningkatkan pemisahan

Elektroforesis berbatas (zone)

Kertas selulosa tidak efektif terhadap pemisahan campuran protein karena selulosa akan menyerap protein sehingga tidak dapat bergerak bebas Pada zone elektroforesis larutan protein diamobilisasi dalam matrik pendukung, medan listrik memisahkan komponen-komponen protein dalam zona-zona berdasarkan ukuran dan muatan. Posisi dan kwantisasi protein dalam zona yang dipisahkan ditentukan dengan pewarnaan. Densitas warna berbanding lurus dengan kwantitas protein dan dapat diestimasi dengan alat densitometer

Sistem bufer pada zone elektroforesis

1.

sistem bufer continuous Gelnya lebih mudah dibuat karena tidak ada gel atas sampel protein diload langsung pada gel resolving Bufer ion dalam gel = bufer running pH konstan Bufer running : 0,5 M Sodium posfat pH 7

2. sistem bufer diskontinuous Campuran protein di dalam gel yang berbeda porositas dan pH bufernya, diletakkan dalam medan listrik. Campuran protein akan bermigrasi dari gel yang lebih poros ke gel yang kurang poros Terdapat 2 lapisan gel Gel bawah (resolving gel) Gel atas ( stacking gel) Gel atas mempunyai konsentrasi akrilamida lebih rendah Bufer gel stacking : 0,5 M Tris-HCl pH 6,8 Bufer gel resolving : 1,5 M Tris-HCl pH 8,8 Bufer running : 15 g trisbase, 72 g glisin dan 5 g SDS 1 L, pH 8,3

Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang (crosslinked) yang porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan protein atau asam nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat yang

Beberapa faktor mempengaruhi kecepatan migrasi dari molekul protein

1. Ukuran molekul protein

Migrasi molekul protein berukuran besar lebih lambat daripada migrasi molekul berukuran kecil. Migrasi molekul protein pada gel berkosentrasi rendah lebih cepat daripada migrasi molekul protein yang sama pada gel berkosentrasi tinggi.

2. Konsentrasi gel

4. Medium penyangga

Medium pendukung ideal untuk elektroforesis adalah bahan kimia inert yang bersifat relatif stabil, mudah ditangani dan mempunyai daya serap yang baik, sebagai migrasi elektron atau penyaringan berdasarkan ukuran molekul seperti gel poliakrilamid
Voltase yang dipakai rendah (100-500) V, kecepatan migrasi molekul sebanding dengan tingginya voltase yang digunakan.

5. Kekuatan voltase

Cara kerja menggunakan metode elektroforesis

1) Ektraksi sampel, 2) Pembuatan gel, 3) Penempatan sampel, 4) Proses Elektroforesis, 5) Visualisasi sistem sampel dan 6) Metode Analisis.

Polyacrylamida gel Electrophoresis (PAGE)

Gel yang dibentuk oleh proses polimerisasi akrilamida : Tingkat pemisahan tinggi untuk protein berukuran kecil, menengah dan asam nukleat ( sampai sekitar 106 daltons ) Interaksi kecil antara molekul yang bermigrasi dengan matrik

PAGE

elektroforesis dilakukan pada kondisi non denaturasi Kondisi elektroforesis di bawah kondisi non denaturasi meminimalkan denaturasi protein Memisahkan protein native, pemisahan didasarkan pada ukuran dan muatan Ukuran pori akrilamid berfungsi sebagai molekul penyaring pada ukuran yg berbeda protein yang bermuatan lebih tinggi akan bergerak lebih cepat Metode ini dapat memisahkan molekul yang berbeda muatannya satu unit Elektroforesis dibawah kondisi non denaturasi umumnya dirun pada bufer pH tinggi (pH 8,8) banyak protein bermuatan negatif dan migrasi menuju anoda

Preparasi PAGE:

Inisiator: - sistem polimerisasi kimia : amonium persulfat ( membentuk radikal bebas ketika dilarutkan dalam air) - Sistem polimerisasi fotokimia : riboflavin dan metilen blue ( membentuk radikal bebas ketika disinari cahaya uv) Katalis : TEMED ( N,N,N,N- Tetramethyleneethylenmediamine)

SDS PAGE
metode pemisahan protein berdasarkan BMnya Elektroforesis dilakukan dibawah kondisi denaturasi - Murah - reproduksibel - metode cepat untuk kwantitasi, membandingkan dan mengkarakterisasi protein

Protein native + merkaptoetanol ditambah SDS kemudian dipanaskan

merkaptoetanol akan membantu denaturasi protein dengan mereduksi seluruh ikatan disulfida Kompleks SDS-protein akan bergerak dalam medan listrik dipengaruhi oleh BM

Molekul yang besar bergerak lebih lambat dari pada molekul yg kecil. SDS digunakan terutama untuk tujuan: Penentuan ukuran protein Penentuan kemurnian protein Kwantitasi protein Analisis jumlah dan ukuran sub unit

% akrilamida 15 % gel 12,5% gel 10 % gel 7,5 % gel 5 % gel

Separating resolution 15 45 kd 15 60 kd 16 75 kd 30 120 kd 60 212 kd

PREPARASI SAMPEL
Protein yang diload per sumur minimal 0,1 g comassie staining Protein yang diload pada sumur maksimal 20-40 g Preparasi bufer sampel 1. SDS digunakan untuk melarutkan dan mendenaturasi protein 2. merkaptoetanol untuk memecah ikatan disulfida 3. Gliserol (urean atau sukrosa) untuk menambah densiti larutan sampel 4. Bufer untuk menjamin nilai pH 5. Bromfenol blue untuk melacak pergerakan protein

staining
Comasie brilliant biru R-250 Silver Direndam jam, kemudian dilakukan destaining dengan memakai asam asetat dan metanol warna biru pada protein sampel terjadi kompleks antara protein dengan comasie brilliant biru

Kwantitasi protein:
Caranya: Potong pita protein dl gel tempatkan dl tabung reaksi Tambah 1 ml SDS 3% dl isopropanol 50% dan tutup dengan parafilm Inkubasi pada 37 oC selama 24 jam Tentukan absorbansi pada 595 nm

Faktor-faktor yang mempengaruhi polimerisasi

1. Tipe-tipe

dan konsentrasi inisiator Methylene blue sistem > persulfat sistem >riboflavin sistem 2. Kemurnian reagen 3. pH Sistem persulfat : pH 7 10 Sistem riboflavin : pH 4 7 Sistem methilen blue : pH 4 8 4. Temperatur Temperatur optimum 23 25 C 5. Intensitas cahaya Jika intensitas cahaya terlalu tinggi maka kecepatan konsumsi katalis menjadi lebih cepat sehingga katalis habis dr sistem sebelum monomer siap dipolimerisasi. Jika intensitas cahaya terlalu rendah maka polimerisasi menjadi lebih lama tercapai 6. Oksigen Adanya oksigen menghambat polimerisasi akrilamid, ketika oksigen terperangkap dalam radikal bebas polimer. 7. Konsentrasi monomer

Mula-mula zone elektroforesis dalam gel poliakrilamida menggunakan gel berbentuk silindris, tetapi sekarang menggunakan gel slab (ketebalan 0,5 1,5 mm). Keuntungan : 1. Sampel banyak 2. Bisa ditentukan berat molekul 3. Bisa dielektroforesis dibawah kondisi yang identik pada gel yang sama 4. Bisa langsung membandingkan pola pita pada sampel yang berbeda

zone elektroforesis dalam gel poliakrilamida menggunakan gel berbentuk silindris

zone elektroforesis dlm gel poliakrilamida menggunakan gel slab

elektroforesis

Elektroforesis Gel Agarosa

Digunakan untuk memisahkan molekul yg berukuran > 1 kb linier dengan struktur dasar : D-galaktosa dan 3.6 anhydro L-galaktosa Faktor-faktor yang mempengaruhi migrasi DNA dalam gel agarosa 1. ukuran molekul DNA 2. [ agarosa ] [agarosa] dlm gel (%) (b/v) efisiensi pemisahan mol DNA (kb) 0,3 5 - 60 0,6 1 - 20 0,7 0,8 - 10 0,9 0,5 - 7 1,2 0,4 - 6 1,5 0,2 - 3 2,0 0,1 - 2

3. Konformasi DNA - Superheliks circular (bentuk I) - Nicked circular (bentuk II) - Linear (bentuk III) DNA berukuran sama tapi dengan topologi yang berbda akan bergerak dengan kecepatan: Bentuk I > Bentuk III > Bntuk II 4. Voltase yg digunakan - fragmen DNA linear sebanding dengan voltase (laju) - Voltase meningkat, efektivitas pemisahan turun

5. Jenis dan kekuatan bufer Pergerakan DNA dipengaruhi oleh komposisi dan ionik strenght bufer elektroforesis Jika tidak ada ion DNA bermigrasi sangat labat Jika ionik strenght tinggi hambatan listrik sangan tinggi panas yang dihasilkan banyak gel meleleh DNA mengalami denaturasi TAE ( tris asetat) TBE ( tris borat) TPE ( tris fosfat)

Staining
Kompleks DNA EtBr cahaya flouresensi uv

Kromatogram