ELEKTROFORESIS

ZUSFAHAIR
 Elektroforesis
adalah ilmu yang mempelajari pergerakan molekul
yang bermuatan dalam medan listrik.
Kecepatan migrasi (V) protein, atau makromolekul lain
seperti DNA dan RNA dalam medan listrik
tergantung pada kekuatan medan listrik (E),
muatan protein (z) dan koefisien gesekan (f)

V = Ez…………... …………….(1)
f
Koefisien gesekan spesifik untuk setiap molekul, maka
gerakan molekul dalam medan listrik dinyatakan
dalam mobilitas molekul ().
  didefinisikan sebagai kecepatan per
satuan medan listrik
 = V …………………… (2)
E
1 sub 2
 = Ez = z
Ef f
  memberi informasi mengenai ukuran
dan bentuk molekul
 Penggunaan Elektroforesis

1. Untuk pemisahan atau pemurnian protein

Pemisahan berdasarkan muatan listrik dan
dibawah pengaruh medan listrik,
2. Penentuan jumlah dan bobot molekul sub unit
protein
 SDS gel elektroforesis
Pembagian Elektroforesis Berdasarkan media
pendukung
► Elektroforesis batas bebas

► Elektroforesis berbatas (zone)

 Eletroforesis batas bebas
► Media pemisahan komponen : larutan bufer tanpa media
penyangga padat
► untuk memisahkan protein dalam larutan dapar yang
ditempatkan dalam tabung berbentuk u.
► Pada kedua ujung diberikan elektrode negatif dan positif
yang kemudian diberi arus searah. Dengan pengaruh
medan listrik tersebut, protein akan bergerak secara bebas
menuju kutub yang belawanan dengan muatannya.
 Elektroforesis berbatas (zone)
 berupa padatan seperti kertas selulosa, gel
pati. agarosa dan gel poliakrilamida
 Sellulosa digunakan sebagai support
untuk senyawa biokimia dengan BM rendah
seperti asam amino dan karbohidrat,
sedangkan gel poliakrilamid and agarosa
secara luas digunakan sebagai support
media molekul-molekul besar.
 Gel bertindak sebagai saringan molekul
yang meningkatkan pemisahan
 Sistem bufer pada zone elektroforesis
1. sistem bufer continuous
 Elektroforesis kontinu yaitu suatu elektroforesis yang dilakukan secara
kontinu.
 Suatu tirai dari kertas saring digunakan dan terendam dalam suatu larutan
buffer.
 Sampel diteteskan. Kedua ujung kertas saring dalam bentuk alur tercelup
dalam dua ruang elektroda. Dengan pemberian tegangan, partikel zat
terlarut mulai bergerak dan komponen terpisahkan dalam berbagai
permukaan
2. sistem bufer diskontinuous
Campuran protein di dalam gel yang berbeda porositas
dan pH bufernya, diletakkan dalam medan listrik.
Campuran protein akan bermigrasi dari gel yang lebih
poros ke gel yang kurang poros
► Terdapat 2 lapisan gel
 Gel bawah (resolving gel)
 Gel atas ( stacking gel)
► Gel atas mempunyai konsentrasi akrilamida lebih rendah
► Bufer gel stacking : 0,5 M Tris-HCl pH 6,8
► Bufer gel resolving : 1,5 M Tris-HCl pH 8,8
► Bufer running : 15 g trisbase, 72 g glisin dan 5 g
SDS  1 L, pH 8,3
 Polyacrylamida gel Electrophoresis
(PAGE)

 banyak digunakan untuk mempelajari ukuran

dan muatan senyawa biomolekul seperti RNA,
DNA dan protein.
 Juga digunakan sebagai metoda untuk
pemurnian
 Prinsipnya didasarkan pada mobilitas partikel
bermuatan dalam medan listrik:
 PAGE
 elektroforesis dilakukan pada kondisi non denaturasi
 Kondisi elektroforesis di bawah kondisi non denaturasi
meminimalkan denaturasi protein
 Kecepatan gerakan partikel bergantung pada
kekuatan medan dan jumlah muatan. Biomolekul
seperti protein memiliki muatan akibat dari adanya
asam amino basa atau asam.
 Ukuran pori akrilamid berfungsi sebagai molekul
penyaring pada ukuran yg berbeda  protein yang
bermuatan lebih tinggi akan bergerak lebih cepat
 Metode ini dapat memisahkan molekul yang berbeda
muatannya satu unit
 Muatan total suatu protein bervariasi dengan
berubahnya pH. Ini dapat dilihat dari kurva titrasi
sebagai berikut:

Di dalam larutannya, protein enzim akan bermuatan

tergantung kpd pH larutan dan ttk isoelektriknya. Pada ttk
isoelektriknya protein tidak akan bergerak dibawah pengaruh
medan listrik. Pd keadaan pH dibawah pI, protein bergerak
sebagai kation dan bergerak ke elektroda negatif.
Pada keadaan pH diatas pI, protein akan bergerak sebagai
anion dan bergerak ke elktroda positif
Preparasi gel poliakrilamida:
Inisiator:
- sistem polimerisasi kimia : amonium persulfat
( membentuk radikal bebas ketika dilarutkan
dalam air)
- Sistem polimerisasi fotokimia : riboflavin dan
metilen blue ( membentuk radikal bebas
ketika disinari cahaya uv)
Katalis : TEMED ( N,N,N’,N’- Tetramethylene-
ethylenmediamine)
Ukuran pori, dan efek“molecular sieving”,
dapat diatur dengan variasi komposisi bis-
akrilamid: akrilamid. Protein yang besar
akan ditahan oleh gel sehingga akan
berjalan lebih lambat dari pada protein
kecil sehingga terjadi pemisahan yang
didasarkan pada perbedaan ukuran.
% akrilamida Separating resolution
15 % gel 15 – 45 kd
12,5% gel 15 – 60 kd
10 % gel 16 – 75 kd
7,5 % gel 30 – 120 kd
5 % gel 60 – 212 kd
Mula-mula zone elektroforesis dalam gel
poliakrilamida menggunakan gel berbentuk
silindris, tetapi sekarang menggunakan gel slab
(ketebalan 0,5 -1,5 mm). Keuntungan :
1. Sampel banyak
2. Bisa ditentukan berat molekul
3. Bisa dielektroforesis dibawah kondisi yang
identik pada gel yang sama
4. Bisa langsung membandingkan pola pita pada
sampel yang berbeda
zone elektroforesis dalam gel poliakrilamida
menggunakan gel berbentuk silindris
zone elektroforesis dlm gel poliakrilamida
menggunakan gel slab

elektroforesis
 Gel dibuffer dan reservoir juga
mengandung buffer. pH dipilih
untuk memastikan protein tetap
bermuatan selama pemisahan.
 Metoda yang paling umum
adalah menggunakan buffer pH
tinggi untuk memastikan semua
protein bermuatan negatif. Pada
kondisi ini semua protein akan
bergerak dengan arah yang
sama dalam gel
 SDS PAGE

metode pemisahan protein berdasarkan BM-nya

Elektroforesis dilakukan dibawah kondisi denaturasi
- Murah
- reproduksibel
- metode cepat untuk kwantitasi, membandingkan
dan mengkarakterisasi protein
Protein native +  merkaptoetanol ditambah SDS
kemudian dipanaskan

 merkaptoetanol akan membantu denaturasi protein

dengan mereduksi seluruh ikatan disulfida
Kompleks SDS-protein akan bergerak dalam medan
listrik dipengaruhi oleh BM
Molekul yang besar bergerak lebih lambat dari pada
molekul yg kecil.
SDS PAGE digunakan terutama untuk tujuan:
Penentuan ukuran protein
Penentuan kemurnian protein
Kwantitasi protein
Analisis jumlah dan ukuran sub unit
Perbandingan PAGE denaturasi dan non denaturasi pada kreatin kinase Yg
diekpresikan di E.Coli.
Kreatin kinase tersusun atas 2 sub unit
M dan B. MM ( pI 6,5); BB (pI 5,0);
MB (pI 5,8),
Analisis PAGE:
1. MM dan BB dimurnikan dan BB
menpumyai mobilitas yang tinggi
(nilai pI paling rendah)
2. Preparasi MB tidak murni dan
mengandung MM sekitar 50% dan
sejumlah kecil BB
Analisis SDS PAGE
PAGE SDS PAGE
1. Preparasi MM terkontaminasi oleh
protein kecil sekitar 40 kD
2. Preparasi MB menpunyai 2 pita
3. Ketiga isoform ketika didenaturasi
mempunyai ukuran sekitar 43- 45 kD
 PREPARASI SAMPEL

Protein yang diload per sumur minimal

0,1 g  comassie staining
2,0 ng  silver staining
Protein yang diload pada sumur maksimal 20-40 g
Preparasi bufer sampel
1. SDS digunakan untuk melarutkan dan mendenaturasi
protein
2.  merkaptoetanol  untuk memecah ikatan disulfida
3. Gliserol (urea atau sukrosa)  untuk menambah densiti
larutan sampel
4. Bufer  untuk menjamin nilai pH
5. Bromfenol blue  untuk melacak pergerakan protein
 staining
• Comasie brilliant biru R-250
• Silver
Direndam ½ jam, kemudian dilakukan destaining
dengan memakai asam asetat dan metanol 
warna biru pada protein sampel  terjadi
kompleks antara protein dengan comasie
brilliant biru
Kwantitasi protein:

Caranya:
 Potong pita protein dl gel tempatkan
dl tabung reaksi
 Tambah 1 ml SDS 3% dl isopropanol
50% dan tutup dengan parafilm
 Inkubasi pada 37 oC selama 24 jam

 Tentukan absorbansi pada 595 nm

Faktor-faktor yang mempengaruhi polimerisasi
1.Tipe-tipe dan konsentrasi inisiator
Methylene blue sistem > persulfat sistem >riboflavin sistem
2. Kemurnian reagen
3. pH
Sistem persulfat : pH 7 – 10
Sistem riboflavin : pH 4 – 7
Sistem methilen blue : pH 4 – 8
4. Temperatur
Temperatur optimum 23 – 25  C
5. Intensitas cahaya
Jika intensitas cahaya terlalu tinggi maka kecepatan konsumsi
katalis menjadi lebih cepat sehingga katalis habis dr sistem
sebelum monomer siap dipolimerisasi.
Jika intensitas cahaya terlalu rendah maka polimerisasi menjadi
lebih lama tercapai
6. Oksigen
Adanya oksigen menghambat polimerisasi akrilamid, ketika oksigen
terperangkap dalam radikal bebas polimer.
7. Konsentrasi monomer
 Elektroforesis Gel Agarosa
Digunakan untuk memisahkan molekul yg berukuran > 1 kb
linier dengan struktur dasar : D-galaktosa dan 3.6 anhydro L-
galaktosa

Faktor-faktor yang mempengaruhi migrasi DNA dalam gel agarosa

1. ukuran molekul DNA
2. [ agarosa ]
[agarosa] dlm gel (%) (b/v) efisiensi pemisahan mol DNA (kb)
0,3 5 - 60
0,6 1 - 20
0,7 0,8 - 10
0,9 0,5 - 7
1,2 0,4 - 6
1,5 0,2 - 3
2,0 0,1 - 2
3. Konformasi DNA
- Superheliks circular (bentuk I)
- Nicked circular (bentuk II)
- Linear (bentuk III)
DNA berukuran sama tapi dengan topologi yang berbda
akan bergerak dengan kecepatan:
Bentuk I > Bentuk III > Bntuk II

4. Voltase yg digunakan
- fragmen DNA linear sebanding dengan voltase (laju)
- 100 v/cm
- keuntungan elektroforesis pada voltase tinggi adalah
terjadinya pemisahan yang sangat cepat
5. Jenis dan kekuatan bufer
Pergerakan DNA dipengaruhi oleh komposisi dan ionik
strenght bufer elektroforesis
 Jika tidak ada ion DNA bermigrasi sangat lambat
 Jika ionik strenght tinggi  hambatan listrik sangat
tinggi  panas yang dihasilkan banyak  gel meleleh
 DNA mengalami denaturasi

TAE ( tris asetat)

TBE ( tris borat)
TPE ( tris fosfat)
 Staining

 Gel direndam dalam larutan buffer TBE

atau TAE yang mengandung ethidium
bromide, selanjutnya ethidium bromide
akan berdifusi ke dalam gel dan
berasosiasi dengan DNA (Switzer, 1999).
 Ethidium bromide mampu berinterkalasi
diantara pasang basa nukleotida pada
struktur double heliks dan saat gel hasil
elektroforesis disinari dengan ultraviolet
maka fragmen-fragmen DNA yang telah
terpisah tampak sebagai band-band
berwarna oranye (Campbell dan Shawn,
2009).
Kromatogram