LAPORAN PRAKTIKUM

ENZIMOLOGI
ISOLASI DAN KARAKTERISASI UREASE DARI BIJI KACANG HIJAU

DISUSUN OLEH :
NAMA : ARY KURNIA ADHI
NIM : K1A018067
KELAS :A

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
JURUSAN KIMIA
LABORATORIUM BIOKIMIA
PURWOKERTO
2020
 DAFTAR ISI
I. TUJUAN ............................................................................................................ 1
II. TINJAUAN PUSTAKA .................................................................................... 1
III. METODOLODI PERCOBAAN ....................................................................... 4
3.1. Alat .................................................................................................................. 4
3.2. Bahan .............................................................................................................. 4
3.3. Prosedur Percobaan .......................................................................................... 4
3.3.1. Isolasi enzim urease dari biji kacang hijau ................................................. 4
3.3.2. Penentuan kurva standar amonium sulfat ................................................... 5
3.3.3. Uji aktivitas enzim urease ekstrak kasar ..................................................... 5
3.3.4. Karakterisasi enzim urease dari biji kacang hijau ....................................... 6
IV. HASIL DAN PEMBAHAN ............................................................................... 7
4.1. Data Pengamatan ............................................................................................. 7
4.1.1 Isolasi Enzim Urease dari Kacang Hijau ..................................................... 7
4.1.2 Penentuan Kurva Standar Ammonium Sulfat .............................................. 8
4.1.3 Uji Aktivitas Enzim Urease ........................................................................ 8
4.1.4 Karakterisasi Enzim Ureasi....................................................................... 10
4.2.Data Perhitungan ............................................................................................ 12
4.2.1 Penentuan kurva standar amonium sulfat .................................................. 12
4.2.2 Uji aktivitas enzim urease ekstrak kasar .................................................... 12
4.2.3 Pengaruh variasi pH terhadap aktivitas urease dari biji kacang hijau ......... 13
4.2.4 Pengaruh penambahan logam terhadap aktivitas urease dari biji kacang ... 14
4.3. Pembahasan ................................................................................................... 15
4.3.1. Kacang Hijau ........................................................................................... 15
4.3.2. Enzim Urease ........................................................................................... 16
4.3.3. Spektrofotometer UV-VIS ....................................................................... 18
4.3.4. Isolasi enzim urease dari biji kacang hijau ................................................ 19
4.3.5. Penentuan kurva standar amonium sulfat.................................................. 21
4.3.6. Uji aktivitas enzim urease ekstrak kasar ................................................... 23
4.3.7. Karakterisasi enzim urease dari biji kacang hijau ..................................... 24
V. KESIMPULAN ............................................................................................... 27
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................. 28
LAMPIRAN ........................................................................................................... 29
Data Pengamatan .................................................................................................. 29

I
 Isolasi Enzim Urease dari Kacang Hijau ............................................................ 29
Penentuan Kurva Standar Ammonium Sulfat .................................................... 30
Uji Aktivitas Enzim Urease ............................................................................... 31
Karakterisasi Enzim Ureasi ............................................................................... 32
Data Perhitungan .................................................................................................. 34
Penentuan kurva standar amonium sulfat ........................................................... 34
Uji aktivitas enzim urease ekstrak kasar ............................................................ 34
Pengaruh variasi pH terhadap aktivitas urease dari biji kacang hijau.................. 35
Pengaruh penambahan logam terhadap aktivitas urease dari biji kacang ............ 36

II
 DAFTAR GAMBAR
Gambar 4.3.1. Kacang Hijau .................................................................................... 16
Gambar 4.3.2. Spektrofotometer UV-Vis ................................................................. 18
Gambar 4.4.3. Kecambah direndam dalam kapas yang diairi .................................... 20
Gambar 4.3.4. Kecambah dimasukkan dalam tempat gelap ...................................... 20
Gambar 4.3.5. Kecambah dihaluskan ....................................................................... 21
Gambar 4.3.6. Alat Sentrifugasi ............................................................................... 21

III
 DAFTAR KURVA
Kurva 4.3.1. Standar Amonium Sulfat ...................................................................... 22
Kurva 4.3.2. Hubungan Variasi pH Terhadap Aktivitas Enzim ................................. 24
Kurva 4.3.3. Pengaruh Penambahan Logam Terhadap Aktivitas Enzim.................... 25

IV
ISOLASI DAN KARAKTERISASI UREASE DARI BIJI KACANG HIJAU

I. TUJUAN

1. Ekstraksi enzim urease dari biji kacang hijau;

2. Melakukan uji aktivitas enzim urease;
3. Melakukan karakterisasi enzim meliputi pH, dan pengaruh penambahan
logam terhadap aktivitas enzim.

II. TINJAUAN PUSTAKA

Kacang hijau (Vigna radiata) adalah sejenis palawija yang dikenal luas di
daerah tropika. Tumbuhan yang termasuk suku polong-polongan (Fabaceae) ini
memiliki banyak manfaat dalam kehidupan sehari-hari sebagai sumber bahan
pangan berprotein nabati tinggi. Kacang hijau di Indonesia menempati urutan
ketiga terpenting sebagai tanaman pangan legum, setelah kedelai dan kacang tanah.
Bagian paling bernilai ekonomi adalah bijinya. Biji kacang hijau direbus hingga
lunak dan dimakan sebagai bubur atau dimakan langsung. Biji matang yang digerus
dan dijadikan sebagai isi onde-onde, bakpau, atau gandas turi. Kecambah kacang
hijau menjadi sayuran yang umum dimakan di kawasan Asia Timur dan Asia
Tenggara dan dikenal sebagai tauge (Dwidjoseputro, 1992).

Enzim merupakan golongan protein yang paling banyak terdapat dalam sel
hidup dan mempunyai fungsi penting sebagai biokatalisator pada reaksi-reaksi
biokimia. Enzim merupakan katalisator pilihan yang diharapkan dapat mengurangi
dampak pencemaran dan pemborosan energi karena reaksinya tidak membutuhkan
energi tinggi, bersifat spesifik, dan tidak beracun. Cara kerja dari enzim ini sendiri
sangat tergantung dari suhu serta lamanya waktu reaksi yang diberikan.
Kemajuan aplikasi enzim dalam bidang teknologi menyebabkan penggunaan enzim
dalam bidang industri baik pangan maupun non pangan semakin meningkat.
Beberapa pengamatan yang telah dilakukan membuktikan bahwa penggunaan
enzim semakin meningkat dari tahun ke tahun mencapai 10-15% (Bonner, 2007).

1
 Enzim adalah senyawa protein yang dapat mempercepat atau mengkatalis
reaksi kimia. Enzim berperan dalam mengubah laju reaksi, sehingga kecepatan
reaksi yang dihasilkan dapat dijadikan keukuran keaktifan enzim. Enzim hanya
dapat bereaksi pada pH dan temperature tertentu. Karena enzim adalah protein,
maka enzim dalam pakan rentan terdenaturasi atau rusak oleh enzim pencernaan
atau sesuatu yang dapat mengubah struktur enzim. Enzim adalah katalisator
organik yang dihasilkan oleh sel hidup. Katalisator adalah substansi yang dapat
merubah kecepatan reaksi kimiawi tetapi tidak merubah hasil reaksi. Ciri yang
khas dari enzim ditandai oleh adanya spesifikasi untuk substrat yang mirip secara
biologis. Adanya enzim dalam proses pencernaan dalam tubuh ternak sangat
membantu dalam proses anabolishme maupun katabolihsme dari bahan makanan.
Dengan adanya bantuan dari enzim amylase ternak mampu memecah rangkaian
pati menjadi molekul-molekul gula yang lebih sederhana. Enzim urease disebut
juga urea amidohidrolases (Bonner, 2007).

Salah satu jenis enzim yaitu enzim urease. Enzim urease atau dikenal juga
dengan urea amidohidrolases banyak ditemukan pada bakteri, fungi, alga,
tumbuhan, dan jaringan hewan. Urease mampu mengkatalis hidrolisis urea menjadi
karbon dioksida dan amonia. Peran utama dari enzim urease yaitu menyediakan
energi internal dan eksternal bagi organisme untuk menggunakan urea sebagai
sumber N. Urea sebelum dihidrolisis termasuk ke dalam molekul non-polar dan
mudah dipengaruhi oleh pergerakan larutan tanah. Oleh karena itu, urease
tergolong ke dalam kelas enzim tanah hidrolase yang mampu mengkatalis
reaksi-reaksi luar maupun dalam organisme serta mensintesisnya (El-Hefnawy et
al., 2014).

Enzim urease merupakan enzim yang mengkatalis hidrolisis dari urea

menjadi karbon dioksida dan ammonia. Enzim urease juga terdapat pada
beberapa jaringan binatang dan pencernaan mikroorganisme. Urea merupakan
salah satu sumber nitrogen non-protein (NPN) yang umum digunakan adalah
urea. Urea dibuat dengan jalan mereaksikan ammonia dan karbondioksida. Urea
merupakan sumber amoniak dari senyawa spesifik, kandungan urea yang tinggi

2
akan dirombak menjadi basa menguap oleh aktivitas bakteri. Tingginya
kandungan urea akan membentuk sejumlah besar amoniak yang mempengaruhi
kenormalan kandungan total volatile basa.Selama penyimpanan, jumlah amoniak
yang terbentuk relatif tidak dipengaruhi oleh suhu (El-Hefnawy et al., 2014).

3
III. METODOLODI PERCOBAAN
3.1. Alat
Alat-alat yang digunakan adalah peralatan gelas laboratorium, mortar dan alu,
magnetic stirrer, sentrifugator, spektrofotometer UV-Vis, inkubator, pH meter,
neraca analitik, lemari pendingin, kain muslin, dan wrapping.
3.2. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan adalah biji kacang hijau, urea (Merck, Jerman),
buffer fosfat pH 7, buffer fosfat pH 6, buffer tris HCl pH 8, pereaksi Nessler
(Merck, Jerman), larutan standar ion logam ZnCl2, PbCl2, CuCl2, aseton, dan
HCl.
3.3. Prosedur Percobaan
3.3.1. Isolasi enzim urease dari biji kacang hijau
Tahap perkecambahan (Zusfahair et al., 2018)
1. Isolasi dilakukan pada bagian biji kacang hijau.
2. Sebanyak 200 gram biji direndam dalam air selama 6 jam
3. Ditiriskan dan dimasukkan ke dalam wadah plastik yang telah diisi
kapas basah
4. Ditutup dengan wrapping dan didiamkan dalam ruang gelap pada
suhu ruang. sampai terbentuk kecambah selanjutnya dipanen.
Tahap ekstraksi (Zusfahair et al., 2018)
1. Kecambah diambil sebanyak 10 gram dan dihaluskan menggunakan
mortar dan alu
2. Direndam dalam 40 mL aseton 20% suhu dingin (4 oC)
3. Dilakukan pengadukan dengan stirrer selama 3 jam hingga dihasilkan
2 lapisan yaitu filtrat dan suspensi.
4. Filtrat dipisahkan dengan menggunakan kain muslin.
5. Filtrat yang didapat disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm
selama 15 menit suhu 4 oC.
6. Supernatan yang dihasilkan digunakan sebagai eksrak kasar.

4
3.3.2. Penentuan kurva standar amonium sulfat
1. Kurva standar ditentukan dengan menggunakan larutan standar
amonium sulfat dengan konsentrasi 30, 40, 50, 60, dan 70 ppm.
2. Larutan standar amonium sulfat diambil sebanyak 2 mL, lalu
ditambahkan dengan 0,5 mL reagen Nessler
3. Larutan didiamkan selama 30 menit dan diencerkan dengan aquades
sampai tanda batas pada labu ukur 25 mL.
4. Larutan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 443 nm
menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Sedangkan, untuk blanko
dibuat dengan 2 mL akuades ditambahkan 0,5 mL reagen Nessler.
5. Data yang diperoleh dibuat grafik antara konsentrasi amonium sulfat
vs absorbansi.
3.3.3. Uji aktivitas enzim urease ekstrak kasar
1. Sebanyak 0,5 mL urea (0,25 M dalam buffer fosfat) dan 0,5 mL
larutan buffer fosfat 0,2 M pH 7 dimasukkan ke dalam tabung.
2. Sebanyak 0,5 mL enzim urease ditambahkan ke dalam tabung.
3. Larutan tersebut diinkubasi selama 10 menit pada suhu 30 °C lalu
didinginkan. Larutan yang telah didinginkan, kemudian ditambahkan
0,5 mL HCl 0,1 M untuk menghentikan aktivitas enzim urease, lalu
ditambahkan dengan 0,5 mL reagen Nessler,
4. Larutan didiamkan selama 30 menit dan diencerkan di labu ukur 25
mL. Tabung blanko dibuat dengan 2 mL akuades ditambah 0,5 mL
reagen Nessler, kemudian didiamkan selama 30 menit dan diencerkan
di labu ukur 25 mL.
5. Masing-masing larutan diukur absorbansinya menggunakan
spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 443 nm.
6. Estimasi urease dilakukan menggunakan kurva standar amonium
sulfat. Satu unit (U) aktivitas urease diartikan sebagai jumlah enzim
yang dibutuhkan untuk membebaskan 1 μM amonia per menit dalam
kondisi pengujian (urea 0,25 M, buffer 0,1 M pH 7 pada 30 °C).

5
3.3.4. Karakterisasi enzim urease dari biji kacang hijau
Karakterisasi enzim hasil isolat ekstrak kasar adalah dengan penentuan
kondisi optimum pH dan penambahan logam terhadap aktivitas enzim.
Pengaruh variasi pH terhadap aktivitas urease dari biji kacang hijau
Penentuan aktivitas urease dilakukan sama seperti pada uji aktivitas
namun dilakukan pada variasi substrat urea pH 6,0; 7,0; dan 8,0.
Pengaruh penambahan logam terhadap aktivitas urease dari biji kacang
hijau (Banerjee dan Aggarwal, 2012)
1. Pengujian pengaruh logam terhadap aktivitas enzim dilakukan
penambahan ion logam CuCl2, PbCl2, dan ZnCl2 dengan konsentrasi
10 ppm.
2. Langkah pertama yaitu sebanyak 0,2 mL larutan ion logam ditambah
ekstrak enzim urease 0,5 mL dan buffer pH 7 0,3 mL,
3. Larutan diinkubasi pada suhu 30 °C selama 10 menit untuk
memberikan waktu yang cukup untuk interaksi logam atau enzim.
4. Larutan yang telah diinkubasi ditambahkan 0,5 mL urea (0,25 M
dalam buffer pH 7) dan setelah 10 menit ditambahkan 0,5 mL HCl
0,1 M untuk menghentikan reaksi.
5. Campuran reaksi ditambahkan 0,5 mL reagen Nessler, kemudian
didiamkan selama 30 menit dan diencerkan di labu ukur 25 mL.
6. Larutan yang dihasilkan dibaca absorbansinya pada panjang
gelombang 443 nm dengan menggunakan spektrofotometer Uv-Vis.

6
IV. HASIL DAN PEMBAHAN
4.1. Data Pengamatan
4.1.1 Isolasi Enzim Urease dari Kacang Hijau
a. Tahap Perkecambahan
Perlakuan Pengamatan
Sebanyak 200 gram biji kacang Setelah direndam biji kacang hijau
hijau direndam dalam air selama 6 lebih lunak
jam.
Setelah itu, direndam dan ditiriskan -
dan dimasukkan ke dalam wadah
plastik yang telah diisi kapas basah.
Wadah ditutup dengan wrapping Tumbuh kecambah
dan didiamkan dalam ruang gelap
Kecambah dipanen setalah 8 hari. Kecambah kualitas baik

b. Tahap Estraksi
Perlakuan Pengamatan
Kecambah diambil sebanyak 10 Lunak berwarna kecoklatan
gram dan dihaluskan menggunakan
mortar dan alu.
Kecambah yang telah halus Keruh kecoklatan
direndam dalam 40 mL aseton 20%
dengan suhu dingin 4 oC.
Setelah itu, dilakukan pengadukan Keruh kecoklatan
dengan stirrer selama 3 jam
Filtrat dipisahkan dengan Sedikit keruh
menggunakan kain muslin lalu
disentrifugasi dengan kecepatan
12.000 rpm selama 15 menit suhu
4oC.

7
4.1.2 Penentuan Kurva Standar Ammonium Sulfat
Pengamatan Perlakuan
Kurva standar ditentukan dengan Tak berwarna
menggunakan larutan standar
amonium sulfat dengan konsentrasi
30, 40, 50, 60, dan 70 ppm.
Larutan standar amonium sulfat Berwarna kuning kecoklatan
diambil sebanyak 2 mL dan
ditambahkan dengan 0,5 mL reagen
Nessler.
Larutan didiamkan selama 30 menit. -
Larutan diencerkan dengan aquades Tak berwarna
sampai tanda batas pada labu ukur
25 mL.
Larutan diukur absorbansinya pada Blanko : 0,005
panjang gelombang 443 nm 30ppm : 0,229
menggunakan spektrofotometer 40ppm : 0,315
UV-Vis. 50ppm : 0,411
60ppm : 0,518
70ppm : 0,595
Blanko dibuat dengan 2 mL akuades Berwarna kuning kecoklatan
ditambahkan 0,5 mL reagen
Nessler.
Data yang diperoleh dibuat grafik -
antara konsentrasi amonium sulfat
vs absorbansi.

4.1.3 Uji Aktivitas Enzim Urease

Perlakuan Pengamatan
Sebanyak 0,5 mL urea (0,25 M dalam Tak berwarna
buffer fosfat) dan 0,5 mL larutan buffer

8
fosfat 0,2 M pH 7 dimasukkan ke dalam
tabung.
Sebanyak 0,5 mL enzim urease Sedikit keruh
ditambahkan ke dalam tabung.
Larutan tersebut diinkubasi selama 10 Sedikit keruh
menit pada suhu 30°C lalu didinginkan.
Larutan yang telah didinginkan Sedikit keruh
kemudian ditambahkan 0,5 mL HCl 0,1
M.
Larutan ditambahkan dengan 0,5 mL Setelah ditambahkan reagen
reagen Nessler kemudian didiamkan nessler kuning kecoklatan
selama 30 menit dan diencerkan pada
abu ukur 25 mL.
Tabung blanko dibuat dengan 2 mL Setelah ditambahkan reagen
akuades ditambah 0,5 mL reagen nessler kuning kecoklatan
Nessler.
Setelah ditambahkan dengan reagen Setelah ditambahkan reagen
Nessler blanko didiamkan selama 30 nessler kuning kecoklatan
menit dan diencerkan pada labu ukur 25
mL.
Masing-masing larutan diukur -
absorbansinya menggunakan
spektrofotometer UV-Vis pada panjang
gelombang 443 nm.
Estimasi urease dilakukan menggunakan Blanko 1, 2, 3: 0,006
kurva standar amonium sulfat. Sampel 1: 0,519
Data absorbansi dicatat pada data Sampel 2: 0,513
percobaan dan dihitung aktivitas enzim Sampel 3: 0,519
urease (U/mL).

9
4.1.4 Karakterisasi Enzim Ureasi
a. Pengaruh Variasi pH terhadap Aktivitas Enzim Urease
Perlakuan Pengamatan
Sebanyak 0,5 mL urea 0,25 M dalam Larutan tak berwarna
buffer phosfat pH 6 dimasukkan
kedalam tabung I; 0,5 mL urea 0,25
M dalam buffer phosfat pH 7
dimasukkan kedalam tabung II; 0,5
ml urea 0,25 M dalam buffer tris HCl
pH 8 dimasukkan kedalam tabung
III.
Seluruh larutan didiamkan selama 30
menit lalu dilakukan pengenceran
pada labu ukur 25 mL.
Pada tabung I ditambahkan buffer Larutan tak berwarna
phosfat pH 6 sebanyak 0,5 mL;
tabung II ditambahkan buffer phosfat
pH 7 sebanyak 0,5 mL; tabung III
ditambahkan buffer tris HCl pH 8
sebanyak 0,5 mL.
Masing-masing tabung ditambahkan Larutan enzim berwarna sedikit
0,5 mL enzim urease. kekuningan
Larutan diinkubasi selama 10 menit Larutan berwarna sedikit
pada suhu 30oC. kekuningan
Setelah itu, ditambahkan 0,5 mL HCl Larutan berwarna kuning
0,1 M, dan 0,5 mL reagen nessler. kecoklatan
Tabung blanko dibuat dengan Larutan berwarna kuning
mereaksikan 2 mL akuades ditambah kecoklatan
dengan 0,5 mL reagen nessler.
Nilai absorbansi diukur dengan -
menggunakan spektrofotometer

10
 Uv-Vis pada panjang gelombang 443
nm.

b. Pengaruh Penambahan Logam terhadap Aktivitas Enzim Urease

Perlakuan Pengamatan
Pengujian pengaruh logam terhadap Larutan tak berwarna
aktivitas enzim dilakukan
penambahan ion logam CuCl2,
PbCl2, dan ZnCl2 dengan
konsentrasi 10 ppm.
Sebanyak 0,2 mL larutan ion logam Larutan tak berwarna
Zn, Pb, dan Cu dimasukkan
berturu-turut kedalam
masing-masing tabung reaksi.
Percobaan dilakukan secara triplo.
Sebanyak 0,3 mL buffer pH 7 (pH Larutan tak berwarna
optimum) ditambahkan kedalam
masing-masing tabung reaksi.
Sebanyak 0,5 mL buffer pH 7 (pH Larutan tak berwarna
optimum) ditambahkan kedalam
tabung reaksi larutan kontrol tanpa
logam.
Ditambahkan sebanyak 0,5 mL Larutan tak berwarna
ekstrak enzim urease, lalu
diinkubasi pada suhu 30 °C selama
10 menit.
Larutan ditambahkan 0,5 mL urea Larutan tak berwarna
(0,25 M dalam buffer pH
7).Kembali diinkubasi selama 10
menit pada suhu 30 oC.

11
 Larutan ditambahkan 0,5 mL HCl Larutan tak berwarna
0,1 M.
Campuran reaksi ditambahkan 0,5 Larutan berwarna kuning
mL reagen Nessler, kemudian kecoklatan
didiamkan selama 30 menit dan
diencerkan pada labu ukur 25 mL.
Larutan yang dihasilkan dibaca
absorbansinya pada panjang
gelombang 443 nm dengan
menggunakan spektrofotometer
Uv-Vis.

4.2. Data Perhitungan

4.2.1 Penentuan kurva standar amonium sulfat

Y = 0,0093X – 0,0589
R2 = 0,9978

4.2.2 Uji aktivitas enzim urease ekstrak kasar

Rumus Uji Aktivitas Enzim Urease :

A(sampel) 𝑥 𝑓𝑝
Aktivitas Urease (U/mL) = Slope x T x Volume

Keterangan

12
A(sampel) : selisih absorbansi sampel dengan blanko
T : waktu inkubasi
V : volume sampel
Slope : kemiringan dari kurva standar ammonium sulfat

Uji Aktivitas Blanko

0,519 0,006
0,513 0,006
0,519 0,006
Rata-rata : 0,517 Rata-rata : 0,006

(0,517−0,006) 𝑥 25
Aktivitas Urease (U/mL) : 0,0093 x 10 x 0,5

: 274,73118 U/mL

4.2.3 Pengaruh variasi pH terhadap aktivitas urease dari biji kacang hijau

pH 6 pH 7 pH 8 Blanko
0,298 0,629 0,364 0,006
0,299 0,614 0,364 0,006
0,292 0,631 0,363 0,006
0,296333 0,624667 0,363333 0,006

A(sampel) 𝑥 𝑓𝑝
Aktivitas Urease (U/mL) = Slope x T x Volume

0,296333−0,006 𝑥 25
pH 6 Aktivitas Urease (U/mL)= 0,0093 x 10 x 0,5

= 156,0194 U/mL

0,624667−0,006 𝑥 25
pH 7 Aktivitas Urease (U/mL)= 0,0093 x 10 x 0,5

= 332,6167 U/mL

13
 0,36333−0,006 𝑥 25
pH 8 Aktivitas Urease (U/mL)= 0,0093 x 10 x 0,5

= 192,1129 U/mL

4.2.4 Pengaruh penambahan logam terhadap aktivitas urease dari biji

kacang

Tanpa Logam Logam Cu Logam Zn Logam Pb Blanko

0,563 0,390 0,456 0,418 0,006
0,562 0,390 0,452 0,414 0,006
0,566 0,391 0,453 0,416 0,006
0,564 0,390 0,454 0,416 0,006

A(sampel) 𝑥 𝑓𝑝
Aktivitas Urease (U/mL) = Slope x T x Volume

0,564−0,006 𝑥 25
Tanpa Logam Aktivitas Urease (U/mL) =
0,0093 x 10 x 0,5

= 300 U/mL
0,390−0,006 𝑥 25
Logam Cu Aktivitas Urease (U/mL) = 0,0093 x 10 x 0,5

= 206,452 U/mL
0,454−0,006 𝑥 25
Logam Zn Aktivitas Urease (U/mL) = 0,0093 x 10 x 0,5

= 240,860 U/mL
0,416−0,006 𝑥 25
Logam Pb Aktivitas Urease (U/mL) = 0,0093 x 10 x 0,5

= 220,430 U/mL

14
4.3. Pembahasan

4.3.1. Kacang Hijau

Kacang hijau (Vigna radiata) adalah sejenis palawija yang dikenal luas di
daerah tropika. Tumbuhan yang termasuk suku polong-polongan (Fabaceae) ini
memiliki banyak manfaat dalam kehidupan sehari-hari sebagai sumber bahan
pangan berprotein nabati tinggi. Kacang hijau di Indonesia menempati urutan
ketiga terpenting sebagai tanaman pangan legum, setelah kedelai dan kacang
tanah. Bagian paling bernilai ekonomi adalah bijinya. Biji kacang hijau direbus
hingga lunak dan dimakan sebagai bubur atau dimakan langsung. Biji matang
yang digerus dan dijadikan sebagai isi onde-onde, bakpau, atau gandas turi.
Kecambah kacang hijau menjadi sayuran yang umum dimakan di kawasan Asia
Timur dan Asia Tenggara dan dikenal sebagai tauge (Dwidjoseputro, 1992).
Kacang hijau memiliki kandungan protein yang cukup tinggi dan merupakan
sumber mineral penting, antara lain kalsium dan fosfor. Sedangkan kandungan
lemaknya merupakan asam lemak tak jenuh. Kandungan kalsium dan fosfor pada
kacang hijau bermanfaat untuk memperkuat tulang. Kacang hijau juga
mengandung rendah lemak yang sangat baik bagi mereka yang ingin menghindari
konsumsi lemak tinggi. Kadar lemak yang rendah dalam kacang hijau menjadikan
bahan makanan atau minuman yang terbuat dari kacang hijau tidak mudah berbau.
Lemak kacang hijau tersusun atas 73% asam lemak tak jenuh dan 27% asam
lemak jenuh. Umumnya kacang-kacangan memang mengandung lemak tak jenuh
tinggi. Asupan lemak tak jenuh tinggi penting untuk menjaga kesehatan jantung.
Kacang hijau mengandung vitamin B1 yang berguna untuk pertumbuhan dan
vitalitas pria. Maka kacang hijau dan turunannya sangat cocok untuk dikonsumsi
oleh mereka yang baru menikah. Kacang hijau juga mengandung multi protein
yang berfungsi mengganti sel mati dan membantu pertumbuhan sel tubuh, oleh
karena itu anak-anak dan wanita yang baru saja bersalin dianjurkan untuk
mengkonsumsinya (Dwidjoseputro, 1992).

15
 Gambar 4.3.1. Kacang Hijau

Klasifikasi ilmiah :
Kerajaan : Plantae
Divisi : Magnoliophyta
Kelas : Magnoliopsida
Ordo : Fabales
Famili : Fabaceae
Genus : Vigna
Spesies : V. radiate
(Dwidjoseputro, 1992).
4.3.2. Enzim Urease

Enzim merupakan protein yang dapat mempercepat laju reaksi atau

mengkatalis reaksi kimia. Karena enzim merupakan protein, maka enzim
rentan terjadi denaturasi atau mengalami kerusakan. Enzim merupakan katalisator
alami atau organik yang dihasilkan oleh sel hidup. Katalisator merupakan
substansi yang dapat mengubah kecepatan reaksi kimia tetapi tidak mengubah
hasil dari suatu reaksi. Ciri khas yang terdapat pada enzim ditandai oleh adanya
spesifikasi untuk substrat. Cara kerja dari enzim sendiri sangat tergantung dari
suhu serta lamanya waktu reaksi yang diberikan (Hamzah, 2014).
Enzim urease merupakan enzim yang mengkatalis hidrolisis urea menjadi
karbon dioksida dan amonia. Enzim urease juga terdapat pada beberapa
jaringan hewan dan pencernaan mikroorganisme. Urea ialah salah satu sumber
nitrogen non-protein yang umum digunakan. Urea dibuat dengan cara

16
mereaksikan amonia dan karbondioksida. Urea merupakan sumber amonia dari
senyawa yang spesifik, kandungan urea yang tinggi akan dihidrolisis oleh
aktivitas bakteri dan akan menyebabkan lingkungan menjadi basa. Karakteristik
urease memiliki pH optimum sebesar 7,4 dan suhu optimum 60°C dengan
enzimatis spesifikasi urea dan hidroksi urea. Aktivitas urease menjadi sangat tidak
aktif apabila dipanaskan dengan suhu tinggi atau mencapai 105°C. Berat molekul
enzim urease sebesar 483.000, Inhibitor urease adalah logam berat (Pb– dan Pb2+)
(Carlini, 2008).
Peran utama urease adalah menyediakan energi internal dan eksternal bagi
organisme untuk menggunakan urea atau hidroksiurea sebagai sumber N. Urea
(sebelum terhidrolisis) merupakan molekul non polar dan mudah dipengaruhi oleh
pergerakan larutan tanah. Urease merupakan enzim yang menghidrolisis urea
menjadi CO2 dan NH3 (Carlini, 2008).
Reaksinya adalah:
(NH2)2 CO + H2O → CO2 + 2NH3
Enzim urease juga ditemukan pada kecambah biji, enzim ini akan mengurai
urea dari aktivitas arginase yaitu enzim yang menghidrolisis senyawa arginina
menjadi ornitina dan urea. Urease merupakan salah satu bentuk enzim yang
berperan dalam metabolisme nitrogen pada saat perkecambahan dan germinasi
tanaman (El-Hefnawy et al., 2014). Proses perkecambahan mengaktivasi
enzim-enzim hidrolitik di antaranya adalah α-amilase yang merombak amilum
menjadi glukosa, fosfatase merombak senyawa mengandung phospat (P), lipase
merombak senyawa lipid, peptidase merombak senyawa protein, dan urease
merombak senyawa urea. Enzim urease dapat mengkalatalis reaksi pemecahan
urea yang bersifat patogen dalam sel tanaman. Germinasi sangat berpengaruh
terhadap pertumbuhan tanaman.
Faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhan biji diantaranya adalah
penyerapan air, intensitas cahaya, oksigen, dan hormon. Pada tahap
perkecambahan akan menghasilkan hormon-hormon pertumbuhan yang diikuti
dengan pengaktifan enzim-enzim hingga pertumbuhan optimum tercapai yaitu
pada saat biji telah sempurna membentuk bagian akar, batang dan daun. Pada

17
praktikum ini kacang hijau akan digunakan sebagai sumber urease (El-Hefnawy et
al., 2014).
4.3.3. Spektrofotometer UV-VIS

Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau absorban suatu

sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Spektrofotometer merupakan
gabungan dari alat optic dan elektrik serta sifat-sifat kimia fisiknya.
Spektrofotometer sesuai dengan namanya merupakan alat yang terdiri dari
spektrometer dan fotometer. Spektrometer menghasilkan sinar dari spektrum
dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas
cahaya yang ditransmisikan atau yang diabsorbsi. Jadi spektrofotometer
digunakan untuk mengukur energi cahaya secara relatif jika energi tersebut
ditransmisikan, direfleksikan atau diemisikan sebagai fungsi dari panjang
gelombang. Suatu spektrofotometer tersusun dari sumber spektrum sinar tampak
yang sinambung dan monokromatis. Sel pengabsorbsi untuk mengukur perbedaan
absorbsi antara cuplikan dengan blanko ataupun pembanding. Spektrofotometer
Uv-Vis merupakan spektrofotometer yang digunakan untuk pengukuran didaerah
ultra violet dan didaerah tampak. Semua metode spektrofotometri berdasarkan
pada serapan sinar oleh senyawa yang ditentukan, sinar yang digunakan adalah
sinar yang semonokromatis mungkin (Day & Underwood 2002).

Gambar 4.3.2. Spektrofotometer UV-Vis

Spektrofotometer UV-Vis (Ultra Violet-Visible) adalah salah satu dari sekian

banyak instrumen yang biasa digunakan dalam menganalisa suatu senyawa kimia.
Spektrofotometer umum digunakan karena kemampuannya dalam menganalisa
begitu banyak senyawa kimia serta kepraktisannya dalam hal preparasi sampel

18
apabila dibandingkan dengan beberapa metode analisa. Spektrofotometri UV/Vis
melibatkan energi elektronik yang cukup besar saat analisis, sehingga
spetrofotometer UV/Vis lebih banyak dipakai untuk analisis kuantitatif dibanding
kualitatif. Spektrofotometri UV-vis adalah pengukuran serapan cahaya di daerah
ultraviolet (200 –350 nm) dan sinar tampak (350 – 800 nm) oleh suatu senyawa.
Serapan cahaya uv atau cahaya tampak mengakibatkan transisi elektronik, yaitu
promosi elektron-elektron dari orbital keadaan dasar yang berenergi rendah ke
orbital keadaan tereksitasi berenergi lebih tinggi. Dimana detector dapat
mengukur intensitas cahaya yang dipancarkan secara tidak langsung cahaya yang
diabsorbsi. Tiap media akan menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu
tergantung pada senyawa atau warna yang terbentuk. Spektrofotometri UV-Vis
merupakan gabungan antara spektrofotometri UV dan Visible. Alat ini
menggunakan dua buah sumber cahaya yang berbeda, yaitu sumber cahaya UV
dan sumber cahaya Visible. Larutan yang dianalisis diukur serapan sinar ultra
violet atau sinar tampaknya. Konsentrasi larutan yang dianalisis akan sebanding
dengan jumlah sinar yang diserap oleh zat yang terdapat dalam larutan tersebut
(Day & Underwood 2002).
4.3.4. Isolasi enzim urease dari biji kacang hijau

4.3.4.1. Tahap perkecambahan

Penelitian dimulai dengan membuat kecambah kacang hijau dengan waktu

inkubasi selama 8 hari. Biji kacang hijau kering direndam di dalam air. Proses
perendaman menjadikan sel-sel pada jaringan tanaman menjadi aktif tumbuh
dikarenakan terjadi proses imbibisi yaitu penyerapan air ke dalam rongga jaringan
tanaman. Penumbuhan kecambah dilakukan pada keadaan gelap berfungsi untuk
menjaga hormon pertumbuhan yaitu hormon auksin. Hormon auksin merupakan
hormon pertumbuhan bagi tanaman yang sangat sensitif terhadap itensitas cahaya
matahari, apabila kecambah terkena cahaya matahari dengan itensitas yang tinggi
maka akan menggangu kerja hormon auksin yang menyebabkan pertumbuhan
kecambah menjadi terhambat dan dapat mengakibatkan kematian (Dwidjoseputro,
1992).

19
 Gambar 4.4.3. Kecambah direndam dalam kapas yang diairi

Gambar 4.3.4. Kecambah dimasukkan dalam tempat gelap

4.3.4.2. Tahap ekstraksi

Kecambah kacang hijau selanjutnya diekstraksi dan sentrifugasi. Kecambah

diambil sebanyak 10 gram dan dihaluskan menggunakan mortar dan alu
selanjutnya direndam dalam 40 mL aseton 20% suhu dingin (4 oC) untuk
mencegah terjadinya denaturasi akibat suhu panas, kemudian dilakukan
pengadukan dengan stirrer selama 3 jam hingga dihasilkan 2 lapisan yaitu filtrat
dan suspensi. Filtrat dipisahkan dengan menggunakan kain muslin. Filtrat yang
didapat disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 15 menit suhu 4 oC.
Supernatan yang dihasilkan digunakan sebagai eksrak kasar. Supernatan yang
diperoleh merupakan ekstrak kasar (Zusfahair et al., 2018).

20
 Gambar 4.3.5. Kecambah dihaluskan
Sentrifugasi adalah proses yang memanfaatkan gaya sentrifugal untuk
sedimentasi campuran dengan menggunakan mesin sentrifuga atau pemusing.
Komponen campuran yang lebih rapat akan bergerak menjauh dari sumbu
sentrifuga dan membentuk endapan (pelet), menyisakan cairan supernatan yang
dapat diambil dengan dekantasi. Teknik sentrifugasi telah dimanfaatkan baik
untuk keperluan penelitian, misalnya pada bidang biologi sel dan biologi
molekular, maupun untuk industry (Jayaraman, 2004).

Gambar 4.3.6. Alat Sentrifugasi

4.3.5. Penentuan kurva standar amonium sulfat

Kurva standar ditentukan dengan menggunakan larutan standar amonium

sulfat dengan konsentrasi 30, 40, 50, 60, dan 70 ppm. Larutan standar amonium
sulfat diambil sebanyak 2 mL, lalu ditambahkan dengan 0,5 mL reagen Nessler
sebagai pemberi warna pada larutan agar dapat diukur absorbansinya kemudian,
didiamkan selama 30 menit agar pencampuran sempurna dan diencerkan dengan
aquades sampai tanda batas pada labu ukur 25 mL. Larutan diukur absorbansinya

21
pada panjang gelombang 443 nm menggunakan spektrofotometer UV-Vis.
Sedangkan, untuk blanko dibuat dengan 2 mL akuades ditambahkan 0,5 mL
reagen Nessler. Data yang diperoleh dibuat grafik antara konsentrasi amonium
sulfat vs absorbansi (Fathima, 2012).
Amonium sulfat digunakan karena enzim urease merupakan enzim yang
menghidrolisis urea menjadi amonia, dan reagen nessler digunakan sebagai
indikator pewarna yang akan bereaksi dengan amonia yang dihidrolisis oleh
enzim urease sehingga aktivitas enzim atau amonium yang dihasilkan oleh
hidrolisis oleh enzim urease dapat di hitung nilai absorbansinya dengan
spektrofotometer, Amonium sulfat disini sebagai kurva standar dimana nantinya
amonium akan bereaksi dengan nessler sehingga dapat dihitung absorbansinya
dan dijadikan standar pada uji aktivitas enzim urease (Fathima, 2012).

Kurva 4.3.1. Standar Amonium Sulfat

Berdasarkan data pengamatan, absorbansi bertambah seiring dengan
bertambahnya konsentrasi, hal ini sesuai referensi karena bertambahnya
konsentrasi larutan akan berpengaruh pada tingkat kepekatan warna sehingga
absorbansinya semakin besar. Dapat dilihat pada kurva bahwa grafik hubungan
konsentrasi dan absorbansi tidak linear pada konsentrasi 60 ppm (Khopkar, 2014).

Faktor-faktor yang menyebabkan absorbansi vs konsentrasi tidak linear:

22
 1. Adanya serapan oleh pelarut. Hal ini dapat diatasi dengan penggunaan
blangko, yaitu larutan yang berisi selain komponen yang akan dianalisis
termasuk zat pembentuk warna.
2. Serapan oleh kuvet. Kuvet yang ada biasanya dari bahan gelas atau kuarsa,
namun kuvet dari kuarsa memiliki kualitas yang lebih baik.
3. Kesalahan fotometrik normal pada pengukuran dengan absorbansi sangat
rendah atau sangat tinggi, hal ini dapat diatur dengan pengaturan
konsentrasi, sesuai dengan kisaran sensitivitas dari alat yang digunakan
(melalui pengenceran atau pemekatan). (Khopkar, 2014).

4.3.6. Uji aktivitas enzim urease ekstrak kasar

Sebanyak 0,5 mL urea (0,25 M dalam buffer fosfat) dan 0,5 mL larutan buffer
fosfat 0,2 M pH 7 dimasukkan ke dalam tabung untuk menjaga stabilitas enzim.
Sebanyak 0,5 mL enzim urease ditambahkan ke dalam tabung. Larutan tersebut
diinkubasi selama 10 menit pada suhu 30 °C lalu didinginkan untuk menjaga suhu
enzim dan mempercepat reaksi. Larutan yang telah didinginkan, kemudian
ditambahkan 0,5 mL HCl 0,1 M untuk menghentikan aktivitas enzim urease, lalu
ditambahkan dengan 0,5 mL reagen Nessler, kemudian didiamkan selama 30
menit dan diencerkan di labu ukur 25 mL. Tabung blanko dibuat dengan 2 mL
akuades ditambah 0,5 mL reagen Nessler, kemudian didiamkan selama 30 menit
dan diencerkan di labu ukur 25 mL. Masing- masing larutan diukur absorbansinya
menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 443 nm.
Estimasi urease dilakukan menggunakan kurva standar amonium sulfat. Satu unit
(U) aktivitas urease diartikan sebagai jumlah enzim yang dibutuhkan untuk
membebaskan 1 μM amonia per menit dalam kondisi pengujian (urea 0,25 M,
buffer 0,1 M pH 7 pada 30 °C). (Jayaraman, 2004).
Uji aktivitas dilakukan dengan metode Nessler. Metode Nessler terdiri dari
suatu analisis kimiawi dengan menggunakan alat spektrofotometer. Reagensia
Nessler [K2HgI4] akan bereaksi dengan NH3. Reaksi yang menghasilkan larutan
berwarna kuning-cokelat yang mengikuti hukum Beer-Lambert. Intensitas warna

23
yang terjadi berbanding lurus dengan konsentrasi NH3 dalam larutan yang bersifat
basa. Endapan cokelat yang dihasilkan atau pewarnaan cokelat atau kuning
dihasilkan sesuai dengan jumlah ammonia atau ion ammonia yang terdapat.
Endapan tersebut adalah merkurium amidoiodida basa yang terdapat dalam
sampel (Khopkar, 2014).
4.3.7. Karakterisasi enzim urease dari biji kacang hijau

4.3.7.1. Pengaruh variasi pH terhadap aktivitas urease dari biji

kacang hijau

Penentuan aktivitas urease dilakukan sama seperti pada uji aktivitas namun
dilakukan pada variasi substrat urea pH 6,0; 7,0; dan 8,0 (Jayaraman, 2004).

Kurva Hubungan Variasi pH Terhadap Aktivitas Enzim

350 332.6167

300

250
Aktivitas U/mL

192.1129
200
156.0194
150

100

50

0
pH 6 pH 7 pH 8

Kurva 4.3.2. Hubungan Variasi pH Terhadap Aktivitas Enzim

Seperti Protein pada umumnya, struktur ion enzim tergantung pada pH
lingkungannya. Enzim dapat berbentuk ion positif, negative, atau bermuatan
ganda (zwitter ion). Dengan demikian perubahan pH lingkungan akan
berpengaruh terhadap efektivitas bagian aktif enzim membentuk kompleks
enzim-substrat. Perubahan pH juga akan menyebabkan terjadinya proses
denaturasi dan akan menurunkan aktivitas enzim. Sehingga ada suatu pH tertentu
atau daerah pH yang dapat menyebabkan kecepatan reaksi paling tinggi yang
dinamakan pH optimum (Bonner, 2007).

24
 Berdasarkan kurva didapat aktivitas enzim paling tinggi pada pH 7 sehingga
pH 7 merupakan pH optimum pada enzim urease (Bonner, 2007).
4.3.7.2. Pengaruh penambahan logam terhadap aktivitas urease dari
biji kacang hijau

Pengujian pengaruh logam terhadap aktivitas enzim dilakukan penambahan

ion logam CuCl2, PbCl2, dan ZnCl2 dengan konsentrasi 10 ppm. Langkah pertama
yaitu sebanyak 0,2 mL larutan ion logam ditambah ekstrak enzim urease 0,5 mL
dan buffer pH 7 0,3 mL, lalu diinkubasi pada suhu 30 °C selama 10 menit untuk
memberikan waktu yang cukup untuk interaksi logam atau enzim. Larutan yang
telah diinkubasi, kemudian ditambahkan 0,5 mL urea (0,25 M dalam buffer pH 7)
dan setelah 10 menit ditambahkan 0,5 mL HCl 0,1 M untuk menghentikan reaksi.
Campuran reaksi ditambahkan 0,5 mL reagen Nessler, kemudian didiamkan
selama 30 menit dan diencerkan di labu ukur 25 mL. Larutan yang dihasilkan
dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 443 nm dengan menggunakan
spektrofotometer Uv-Vis (Banerjee, 2012).

Kurva Pengaruh Penambahan Logam Terhadap

Aktivitas Enzim
350
300
300
240.86
250 220.43
Aktivitas U/mL

206.452
200

150

100

50

0
Tanpa Logam Logam Cu Logam Zn Logam Pb

Kurva 4.3.3. Pengaruh Penambahan Logam Terhadap Aktivitas Enzim

Dapat dilihat pada kurva bahwa aktivitas control sebesar 300 U/mL, ion
Logam Cu 206,452 U/mL atau memiliki aktivitas relative 68,81% dari control,
Logam Zn 240,86 atau memiliki aktivitas relatif 80,287% dari control, dan Logam

25
Pb 220,43 atau memiliki aktivitas relatif 73,477% dari control. Hal ini
dikarenakan logam berat berperan sebagai inhibitor. Inhibitor dapat bergabung
dengan enzim pada suatu bagian enzim diluar bagian aktif. Penggabungan antara
inhibitor dengan enzim ini terjadi pada enzim bebas menghasilkan kompleks EI,
atau pada enzim yang telah mengikat substrat menghasilkan kompleks ESI yang
keduanya bersifat inaktif (Banerjee, 2012).
Reaksi :
Enzim-SH + Cu2+ => Enzim-S-Cu + 2H+
Enzim-SH + Zn2+ => Enzim-S-Zn + 2H+
Enzim-SH + Pb2+ => Enzim-S-Pb + 2H+
(Banerjee, 2012).

26
V. KESIMPULAN

1. Ekstraksi adalah suatu proses pemisahan suatu zat berdasarkan perbedaan

kelarutannya terhadap dua cairan tidak saling larut yang berbeda,
biasanya air dan yang lainnya pelarut organik.
2. Uji aktivitas dilakukan dengan metode Nessler. Metode Nessler terdiri
dari suatu analisis kimiawi dengan menggunakan alat spektrofotometer.
Reagensia Nessler [K2HgI4] akan bereaksi dengan NH3. Reaksi yang
menghasilkan larutan berwarna kuning-cokelat yang mengikuti hukum
Beer-Lambert.
3. Karakterisasi enzim urease didapat pH optimum enzim urease adalah pH
7 dan aktivitas penambahan ion logam, aktivitas control sebesar 300
U/mL, ion Logam Cu 206,452 U/mL atau memiliki aktivitas relatif
68,81% dari control, Logam Zn 240,86 atau memiliki aktivitas relatif
80,287% dari control, dan Logam Pb 220,43 atau memiliki aktivitas
relatif 73,477% dari control.

27
 DAFTAR PUSTAKA

Banerjee, S. and Aggarwal, A. 2012. Isolation, Partial Purification,

Characterization and Inhibition of Urease (EC 3.5. 1.5) Enzyme from the
Cajanus cajan Seeds. Asian Journal of Bio Science 7, 203-209.
Bonner, P. L. 2007. Protein purification. Garland Science.
Carlini, C.R. and Polacco, J.C. 2008. Toxic Properties of Urease. Crop Science 48,
1665- 1672.
Day & Underwood.(2002). Analisis Kimia Kuantitatif. Jakarta: Erlangga.
Dwidjoseputro, D. 1992. Pengantar fisiologi tumbuhan. PT Gramedia Pustaka
Utama.
El-Hefnawy, M.E., Sakran, M., Ismail, A.I. and Aboelfetoh, E.F. 2014. Extraction,
Purification, Kinetic and Thermodynamic Properties of Urease from
Germinating Pisum Sativum L. seeds. BMC biochemistry 15, 15.
Fathima, F. and Jayalakshmi, S. 2012. Characterization of urease enzyme from
marine bacterium Klebsiella species. African Journal of Microbiology
Research 6, 5914- 5923.
Hamzah, N.A. 2014. Main Properties of Urease Partially Purified from Seeds of
Syrian mesquite (Prosopis farcta). Journal of Babylon University Pure and
Applied Sciences 22(3), 1071-1079.
Jayaraman, J. and Jayaraman, J. 2004. Laboratory Manual in Biochemistry,
Kalyani Publishers.
Khopkar, S.M.(2014).Konsep Dasar Kimia Analitik Jakarta: UI-Press.
Zusfahair, Ningsih, D. R., Fatoni, A., dan Putri, D. 2018. Partial purification and
characterization of urease from black-eyed pea (Vigna unguiculata ssp
unguiculata L.). Malaysian Journal of Fundamental and Applied Sciences,
14(1): 20–24.
Zusfahair, Ningsih, D. R., Fatoni, A., dan Pertiwi, D. S. 2018. Pemurnian Parsial
dan Karakterisasi Urease dari Biji Kacang Panjang (Vigna unguiculata
subsp sesquipedalis L.). Alchemy Jurnal Penelitian Kimia, 14(1): 72-83.

28
LAMPIRAN

Data Pengamatan
Isolasi Enzim Urease dari Kacang Hijau
Tahap Perkecambahan
Perlakuan Pengamatan
Sebanyak 200 gram biji kacang Setelah direndam biji kacang hijau
hijau direndam dalam air selama 6 lebih lunak
jam.
Setelah itu, direndam dan ditiriskan -
dan dimasukkan ke dalam wadah
plastik yang telah diisi kapas basah.
Wadah ditutup dengan wrapping Tumbuh kecambah
dan didiamkan dalam ruang gelap
Kecambah dipanen setalah 8 hari. Kecambah kualitas baik

Tahap Estraksi
Perlakuan Pengamatan
Kecambah diambil sebanyak 10 Lunak berwarna kecoklatan
gram dan dihaluskan menggunakan
mortar dan alu.
Kecambah yang telah halus Keruh kecoklatan
direndam dalam 40 mL aseton 20%
dengan suhu dingin 4 oC.
Setelah itu, dilakukan pengadukan Keruh kecoklatan
dengan stirrer selama 3 jam
Filtrat dipisahkan dengan Sedikit keruh
menggunakan kain muslin lalu

29
 disentrifugasi dengan kecepatan
12.000 rpm selama 15 menit suhu
4oC.

Penentuan Kurva Standar Ammonium Sulfat

Pengamatan Perlakuan
Kurva standar ditentukan dengan Tak berwarna
menggunakan larutan standar
amonium sulfat dengan konsentrasi
30, 40, 50, 60, dan 70 ppm.
Larutan standar amonium sulfat Berwarna kuning kecoklatan
diambil sebanyak 2 mL dan
ditambahkan dengan 0,5 mL reagen
Nessler.
Larutan didiamkan selama 30 menit. -
Larutan diencerkan dengan aquades Tak berwarna
sampai tanda batas pada labu ukur
25 mL.
Larutan diukur absorbansinya pada Blanko : 0,005
panjang gelombang 443 nm 30ppm : 0,229
menggunakan spektrofotometer 40ppm : 0,315
UV-Vis. 50ppm : 0,411
60ppm : 0,518
70ppm : 0,595
Blanko dibuat dengan 2 mL akuades Berwarna kuning kecoklatan
ditambahkan 0,5 mL reagen
Nessler.
Data yang diperoleh dibuat grafik -
antara konsentrasi amonium sulfat
vs absorbansi.

30
Uji Aktivitas Enzim Urease
Perlakuan Pengamatan
Sebanyak 0,5 mL urea (0,25 M dalam Tak berwarna
buffer fosfat) dan 0,5 mL larutan buffer
fosfat 0,2 M pH 7 dimasukkan ke dalam
tabung.
Sebanyak 0,5 mL enzim urease Sedikit keruh
ditambahkan ke dalam tabung.
Larutan tersebut diinkubasi selama 10 Sedikit keruh
menit pada suhu 30°C lalu didinginkan.
Larutan yang telah didinginkan Sedikit keruh
kemudian ditambahkan 0,5 mL HCl 0,1
M.
Larutan ditambahkan dengan 0,5 mL Setelah ditambahkan reagen
reagen Nessler kemudian didiamkan nessler kuning kecoklatan
selama 30 menit dan diencerkan pada
abu ukur 25 mL.
Tabung blanko dibuat dengan 2 mL Setelah ditambahkan reagen
akuades ditambah 0,5 mL reagen nessler kuning kecoklatan
Nessler.
Setelah ditambahkan dengan reagen Setelah ditambahkan reagen
Nessler blanko didiamkan selama 30 nessler kuning kecoklatan
menit dan diencerkan pada labu ukur 25
mL.
Masing-masing larutan diukur -
absorbansinya menggunakan
spektrofotometer UV-Vis pada panjang
gelombang 443 nm.
Estimasi urease dilakukan menggunakan Blanko 1, 2, 3: 0,006
kurva standar amonium sulfat. Sampel 1: 0,519
Data absorbansi dicatat pada data Sampel 2: 0,513

31
 percobaan dan dihitung aktivitas enzim Sampel 3: 0,519
urease (U/mL).

Karakterisasi Enzim Ureasi

Pengaruh Variasi pH terhadap Aktivitas Enzim Urease
Perlakuan Pengamatan
Sebanyak 0,5 mL urea 0,25 M dalam Larutan tak berwarna
buffer phosfat pH 6 dimasukkan
kedalam tabung I; 0,5 mL urea 0,25
M dalam buffer phosfat pH 7
dimasukkan kedalam tabung II; 0,5
ml urea 0,25 M dalam buffer tris HCl
pH 8 dimasukkan kedalam tabung
III.
Seluruh larutan didiamkan selama 30
menit lalu dilakukan pengenceran
pada labu ukur 25 mL.
Pada tabung I ditambahkan buffer Larutan tak berwarna
phosfat pH 6 sebanyak 0,5 mL;
tabung II ditambahkan buffer phosfat
pH 7 sebanyak 0,5 mL; tabung III
ditambahkan buffer tris HCl pH 8
sebanyak 0,5 mL.
Masing-masing tabung ditambahkan Larutan enzim berwarna sedikit
0,5 mL enzim urease. kekuningan
Larutan diinkubasi selama 10 menit Larutan berwarna sedikit
pada suhu 30oC. kekuningan
Setelah itu, ditambahkan 0,5 mL HCl Larutan berwarna kuning
0,1 M, dan 0,5 mL reagen nessler. kecoklatan
Tabung blanko dibuat dengan Larutan berwarna kuning
mereaksikan 2 mL akuades ditambah kecoklatan

32
dengan 0,5 mL reagen nessler.
Nilai absorbansi diukur dengan -
menggunakan spektrofotometer
Uv-Vis pada panjang gelombang 443
nm.

Pengaruh Penambahan Logam terhadap Aktivitas Enzim Urease

Perlakuan Pengamatan
Pengujian pengaruh logam terhadap Larutan tak berwarna
aktivitas enzim dilakukan
penambahan ion logam CuCl2,
PbCl2, dan ZnCl2 dengan
konsentrasi 10 ppm.
Sebanyak 0,2 mL larutan ion logam Larutan tak berwarna
Zn, Pb, dan Cu dimasukkan
berturu-turut kedalam
masing-masing tabung reaksi.
Percobaan dilakukan secara triplo.
Sebanyak 0,3 mL buffer pH 7 (pH Larutan tak berwarna
optimum) ditambahkan kedalam
masing-masing tabung reaksi.
Sebanyak 0,5 mL buffer pH 7 (pH Larutan tak berwarna
optimum) ditambahkan kedalam
tabung reaksi larutan kontrol tanpa
logam.
Ditambahkan sebanyak 0,5 mL Larutan tak berwarna
ekstrak enzim urease, lalu
diinkubasi pada suhu 30 °C selama
10 menit.
Larutan ditambahkan 0,5 mL urea Larutan tak berwarna

33
 (0,25 M dalam buffer pH
7).Kembali diinkubasi selama 10
menit pada suhu 30 oC.
Larutan ditambahkan 0,5 mL HCl Larutan tak berwarna
0,1 M.
Campuran reaksi ditambahkan 0,5 Larutan berwarna kuning
mL reagen Nessler, kemudian kecoklatan
didiamkan selama 30 menit dan
diencerkan pada labu ukur 25 mL.
Larutan yang dihasilkan dibaca
absorbansinya pada panjang
gelombang 443 nm dengan
menggunakan spektrofotometer
Uv-Vis.

Data Perhitungan

Penentuan kurva standar amonium sulfat

Y = 0,0093X – 0,0589
R2 = 0,9978

Uji aktivitas enzim urease ekstrak kasar

Rumus Uji Aktivitas Enzim Urease :

34
 A(sampel) 𝑥 𝑓𝑝
Aktivitas Urease (U/mL) = Slope x T x Volume

Keterangan
A(sampel) : selisih absorbansi sampel dengan blanko
T : waktu inkubasi
V : volume sampel
Slope : kemiringan dari kurva standar ammonium sulfat

Uji Aktivitas Blanko

0,519 0,006
0,513 0,006
0,519 0,006
Rata-rata : 0,517 Rata-rata : 0,006

(0,517−0,006) 𝑥 25
Aktivitas Urease (U/mL) : 0,0093 x 10 x 0,5

: 274,73118 U/mL

Pengaruh variasi pH terhadap aktivitas urease dari biji kacang hijau

pH 6 pH 7 pH 8 Blanko
0,298 0,629 0,364 0,006
0,299 0,614 0,364 0,006
0,292 0,631 0,363 0,006
0,296333 0,624667 0,363333 0,006

A(sampel) 𝑥 𝑓𝑝
Aktivitas Urease (U/mL) = Slope x T x Volume

0,296333−0,006 𝑥 25
pH 6 Aktivitas Urease (U/mL)= 0,0093 x 10 x 0,5

= 156,0194 U/mL

35
 0,624667−0,006 𝑥 25
pH 7 Aktivitas Urease (U/mL)= 0,0093 x 10 x 0,5

= 332,6167 U/mL

0,36333−0,006 𝑥 25
pH 8 Aktivitas Urease (U/mL)= 0,0093 x 10 x 0,5

= 192,1129 U/mL

Pengaruh penambahan logam terhadap aktivitas urease dari biji kacang

Tanpa Logam Logam Cu Logam Zn Logam Pb Blanko

0,563 0,390 0,456 0,418 0,006
0,562 0,390 0,452 0,414 0,006
0,566 0,391 0,453 0,416 0,006
0,564 0,390 0,454 0,416 0,006

A(sampel) 𝑥 𝑓𝑝
Aktivitas Urease (U/mL) = Slope x T x Volume

0,564−0,006 𝑥 25
Tanpa Logam Aktivitas Urease (U/mL) = 0,0093 x 10 x 0,5

= 300 U/mL
0,390−0,006 𝑥 25
Logam Cu Aktivitas Urease (U/mL) = 0,0093 x 10 x 0,5

= 206,452 U/mL
0,454−0,006 𝑥 25
Logam Zn Aktivitas Urease (U/mL) = 0,0093 x 10 x 0,5

= 240,860 U/mL
0,416−0,006 𝑥 25
Logam Pb Aktivitas Urease (U/mL) = 0,0093 x 10 x 0,5

= 220,430 U/mL

36