zusfahair

KROMATOGRAFI
 Adalah teknik yang banyak digunakan untuk
memisahkan dan mengindentifikasi senyawa kimia.
 merupakan cara pemisahan berdasarkan perbedaan
interaksi antara komponen-komponen yang akan
dipisahkan dengan fasa diam dan fasa gerak.

 KROMATOGRAFI FILTRASI GEL

 KROMATOGRAFI PENUKAR ION
 KROMATOGRAFI AFINITAS
 KROMATOGRAFI FILTRASI GEL

• digunakan untuk memisahkan protein berdasarkan ukuran

• Bekerja sebagai suatu penyaring molekul
• salah satu bahan yang dapat digunakan adalah sephadex
(polimer gula yg biasanya larut dalam air) yg telah
mengalami “cross linkage” dengan bantuan epikhlorhidrin
→ sephadex tidak larut dalam air akan tetapi dapat
menyerap molekul-molekul air di dl molekulmya sendiri.
Daya serap tergantung pd jumlah ikatan silang yang
terjadi.
• Sephadex yang biasa digunakan adalah sephadex G 25,
sephadex G 50 dsb (G = dikembangkan dengan air)
Spesifikasi sephadex
Jenis kisaran fraksionasi peptida
dan protein globular
Sephadex G-10 - 700
G-15 - 1.500
G-25 1.000 - 5.000
G-50 1.500 - 30.000
G-75 3.000 - 70.000
G-100 4.000 - 150.000
G-150 5.000 - 400.000
G-200 5.000 – 800.000
• gel sephadex yang berfungsi sebagai fase diam dan larutan buffer
fosfat pH 8 yang berfungsi sebagai fase gerak
• Campuran protein yang dilarutkan dalam bufer yang sesuai dibiarkan
mengalir berdasarkan gaya grafitasi melalui suatu kolom berisi
sephahex
• Sampel enzim/protein yang memiliki bobot molekul lebih besar dari
pori-pori gel akan melewati ruang antar pori-pori sehingga akan lebih
dahulu keluar dari kolom sebaliknya yang berbobot molekul lebih kecil
akan masuk ke dalam pori-pori matriks sehingga akan keluar lebih
lambat.
• Setelah proses kolom berlangsung, eluen ditampung pada wadah
sebesar 15 ml.
• Eluen yang telah ditampung pada wadah kemudian diukur kadar
protein dan aktivitas enzimnya.
Pemisahan tiga protein dengan ukuran berbeda dg
kromatografi filtrasi gel
Separation of proteins by size: gel filtration
chromatography
Elusi campuran protein dan kolom filtrasi
gel penentuan BM
Kromatografi penukar ion
 Dalam kromatografi kolom penukar ion terdapat dua
fasa, yaitu fasa diam dan fasa gerak.
 Syarat-syarat bahan yang bisa digunakan untuk fasa
diam adalah tidak terlarut pada fasa gerak, stabil pada
kondisi proses yang dikehendaki dan mampu
menyerap zat-zat yang dipisahkan.
 bahan yang bisa dipakai sebagai fasa gerak harus
mempunyai sifat - sifat tidak melarutkan fasa diam,
stabil terhadap kondisi proses dan mampu
melepaskan atau melarutkan unsur - unsur atau ion -
ion yang terserap/terikat pada fasa diamnya, dengan
besar kelarutan yang berbeda - beda
 Kromatografi penukar ion
 Bahan yang dipakai untuk fasa diam adalah resin penukar ion. Resin
penukar ion ini dapat menyerap ion – ion yang dipisahkan, dengan
menukarkan ion - ion yang sesuai antara ion fasa diamnya dengan
ion pada fasa geraknya.
 Dalam proses pertukaran ion, fasa gerak bertugas mengambil
kembali ion-ion yang terkait pada penukar ion dengan jalan
mengalirkannya melalui tumpukan penukar ion.
 Pada umumnya proses ini berlangsung pada sebuah kolom, dan
fasa gerak ini dialirkan dari atas ke bawah dengan kecepatan
tertentu,sehingga mampu menyebabkan reaksi pertukaran ion ketika
fasa gerak mengalir melalui tumpukan resin penukar ion.
 Kromatografi penukar ion
 Proses pengikatan (adsorbsi) ion yang akan dipisahkan oleh
penukar ion disebut dengan pembebanan,
 reaksi pelepasan kembali ion-ion yang terserap pada penukar ion
oleh fasa gerak disebut dengan elusi, dan fasa geraknya sendiri
disebut eluen.
 Elusi sangat menentukan keberhasilan proses pemisahan antara ion
yang satu dengan ion dengan ion yang lain. Proses pemisahan
terjadi ketika ion - ion bergerak turun secara berurutan eluat
bersama-sama dengan eluen dengan kecepatan yang berbeda
yang tergantung pada besarnya koefisien distribusi masing-masing
ion.
 Kromatografi penukar ion
 Memanfaatkan perbedaan afinitas molekul bermuatan di
dalam larutan dengan senyawa tidak reaktif yg berfungsi sbg
pengisi kolom yang bermuatan berlawanan
 Bila suatu protein bermuatan positif pada pH 7 , maka
protein tsb akan terikat dl kolom dg butir-butir gugus
karboksilat, sedangkan protein bermuatan negatif tidak.
 Protein bermuatan positif yg terikat pd kolom dpt dilepas dg
menaikkan kons NaCl dalam bufer elusi.
 Kromatografi Pertukaran Ion
Enzime memiliki muatan bersih dalam larutan, tergantung
pada pH lingkungan, dan titik isoelektriknya (dalam
larutan yang berpH lebih rendah daripada titik
isoelektriknya protein akan bermuatan positif dan
berikatan dengan penukar kation, sedangkan dalam larutan
berpH di atas titik isoelektriknya protein akan bermuatan
negatif sehingga berikatan dengan penukar anion).
Reaksi penukaran antara penukar ion dan
protein :
❑( R-Na+) + protein + → (R- protein+} + Na+
penukar kation
❑( R+Cl-) + protein - → (R+ protein-} + Cl-
penukar anion

Bahan penukar ion biasa adalah polimer yang

bersifat tak larut air yang memiliki gugus kation
atau anion.
R- dan R+ adalah resin tidak larut yang menukarkan
kation ( CMC-selulosa = karboksimetilselulosa) dan
anion (DEAE-selulosa = dietilaminoetilselulosa)
Matrik Penukar Ion

Penukar kation Penukar anion

 Kromatografi Pertukaran Ion
Dielusi menggunakan

➢ Perubahan pH untuk
menetralkan muatan gugus
bahan terlarut atau fasa diam.
➢ Meningkatkan konsentrasi garam
(khususnya polivalensi) dalam
larutan eluen
--> Ion garam menggantikan
protein terikat penukar ion.
➢ pH atau gradien konsentrasi
garam untuk pemisahan.
Pemisahan Protein melalui
Kromatografi Penukar Ion
0M 1M
0.6
0.5
0.4

OD280
0.3
0.2
0.1
0
0 20 40 60
Tube no

NaCl Gradient
1 2 3 4 5 n
(from 0-1 M)
Pemisahan Protein melalui
Kromatografi Penukar Ion
0 M
0.6
0.2 M
0.4 M 0.5
0.6 M 0.4

OD280
0.8 M 0.3
0.2
0.1
0
0 20 40 60
Tube no

NaCl step wise

1 2 3 4 5 n (from 0-0.8 M)
Kromatografi affinitas

Kromatografi afinitas merupakan metode pemisahan

campuran biokimia berdasarkan interaksi biologis
spesifik,seperti antara antigen dan antibodi, enzim dan
substrat atau reseptor dan ligan.
Keterbatasan metode ini adalah protein yang akan
dimurnikan harus berinteraksi secara spesifik dengan
suatu ligan. Jadi, jika tidak diketahui ligan yang dapat
berinteraksi secara spesifik maka tidak dapat dilakukan
pemurnian satu tahap..
 Kromatografi affinitas

❑ Ciri yang menonjol pada kromatografi afinitas adalah

kemampuannya untuk secara selektif mengeluarkan satu protein
tertentu, atau yang paling sering,sejumlah kecil protein tertentu,
dari campuran protein yang kompleks.
❑ Teknik ini menggunakan suatu ligand tak bergerak yang
mengadakan interaksi spesifik dengan enzim yang ingin
dimurnikan.
❑ Protein yang tidak di kehendaki akan mengalir lewat kolom dan
dibuang.
❑ Protein yang di kehendaki kemudian akan dielusikan dari ligan
yang tak bergerak memakai cairan elusi yang umumnya berupa
larutan garam atau ligand berbentuk larut dengan konsentrasi
tinggi.
 Kromatografi Afinitas
❖ Pengikatan enzim pada bahan dalam kolom
terjadi karena interaksi biospecifik

Bahan yang Ligan yang diimobilisasi

dipisahkan
enzim Substrat, koenzim,
inhibitor kompetitif
antigen antibodi
antibodi antigen, bagian dari sel
hormon reseptor, protein pengikat
hormon
reseptor molekul efektor, mis.
hormon, neurotoksin
Kromatogarfi afinitas dapat digunakan
dalam beberapa keperluan yaitu :

1. Pemurnian molekul dari suatu

campuran kedalam larutan buffer.
2. Mengurangi jumlah molekul dalam
campuran
3. Melihat komponen biologi yang
terikat pada molekul partikular
seperti obat-obatan. dll
 Bentuk umum kromatografi afinitas

Matriks : untuk penempelan ligan, matrik fase diam tak

aktif secara kimia dan fisik.

Bagian lengan : digunakan untuk meningkatkan

pengikatan antara ligan dan molekul target.

Ligan ; molekul yang mengikat secara reversible dan

bersifat spesifik pada molekul target

Binding : kondisi buffer optimal untuk mengetahui bahwa molekul target

berinteraksi secara efektif dengan ligan dan dipertahankan
melalui medium afinitas

Elution : kondisi buffer diganti dengan interaksi reverse antara molekul

target dan ligand sehingga molekul target dapat dilarutkan dari
kolom
Interaksi biologi antara ligand dan molekul target dapat
menghasilkan interaksi elektrostatik hidrofobik, vander
waals dan ikatan hidrogen

Keberhasilan pemurnian dengan afinitas

membutuhkan biospesifik ligan yang secara
kovalen terikat pada matrik kromatografi
Medium kromatografi afinitas

1. Matriks : untuk penempelan ligand

beberapa sifat yang diperlukan :
- kemampuan menyerap rendah (low non-specific adsorption)
- group hydroxyl pada residu gula
- struktur pori terbuka dengan aktifitas tinggi dalam pengikatan (binding)
- Stabil pada kondisi eksperimental seperti pada pH tinggi dan rendah,
detergent
Contoh untuk matriks : Sepharose dan agarose

Struktur agarose
 2. Ligand
Merupakan molekul yang mengikat secara reversible
pada spesifik molekul
Pemilihan ligand terdiri 2 faktor :
- Harus spesifik dan reversible binding affinity
dissociation constant (kD) pada ligand - target complex yang
ideal berkisar10-4 sampai 10-8 M pada free solution.

3. Bagian tangan : digunakan untuk meningkatkan

pengikatan antara ligan dan molekul target.
Separation of proteins by specific binding to another
molecule: affinity chromatography
Tahapan dalam kromatografi afinitas
Kromatografi afinitas
 Berdasarkan afinitas spesifik berbagai protein
terhadap gugus kimia tertentu.
 Konkanavalin A, suatu protein dapat
dipisahkan dg melewatkan ekstrak kasar
protein pada kolom butiran yang mengikat
selulosa secara kovalen (konkanavalin A akan
terikat pada kolom sebab konkanavalin A
mempunyai afinitas yg tinggiterhadap glukosa,
sedang kebanyakan protein lain tidak)
 Konkanavalin A yg terikat pd kolom dpt dilepas
dg penambahan larutan gula pekat
Terima Kasih